抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）是由單克隆抗體（mAb）與高活性載荷（payload）通過化學(xué)連接子偶聯(lián)而成,。單抗作為載體將小分子藥物靶向運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞中,。由于其明確的靶向性、遞送治療藥物的有效性,，ADC 藥物成為當(dāng)前治療腫瘤疾病藥物的新方向,。ADC 給藥后在生物機(jī)體內(nèi)會以多種形式存在，包括 ADC,、ADC 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,、游離載荷,、載荷-部分連接子及其相關(guān)代謝產(chǎn)物等。全面地了解 ADC 藥物的藥代動力學(xué)特性,，對于 ADC 藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)至關(guān)重要,。
Trastuzumab deruxtecan（DS-8201; ENHERTU®）是由第一三共和阿斯利康合作開發(fā)的新型 HER2 靶向 ADC。Deruxtecan 是毒性藥物 DX-8951 的衍生物（Dxd）和連接子馬來酰亞胺 -GGFG 肽的偶聯(lián)物,，已被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性 HER2 陽性乳腺癌患者,。
本文以 DS-8201 為例，利用 BioZen MagBeads 鏈霉親和素磁珠提取凈化方式,，Biozen peptide XB-C18 分析,，建立一種檢測總抗體和結(jié)合型載荷的 LC-MS/MS 定量分析方法。
MagBeads 活化
取圖 1. MagBeads 經(jīng)過 PBS 清洗后,，與生物素山羊抗人混合孵育后 PBS 清洗,，磁力架棄去上清；
圖 1. MagBeads 原包裝
免疫捕獲
加入血漿樣本,，混合孵育,，磁力架棄去上清；
圖 2. 分散清洗
淋洗和洗脫
分別使用 PBS 和碳酸氫銨溶液清洗 MagBeads,，磁力架棄去上清,；用 0.1% TFA 震蕩洗脫，磁力架收集上清液,；
圖 3. 磁力架棄去上清
酶解
總抗與 Payload 分別用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解：
酶解結(jié)束后,，均加入 10% FA 乙腈終止，離心待上機(jī)測試,。
色譜條件
色譜柱：Biozen peptide XB-C18（2.1 × 100 mm, 1.7 μm）,；P/N: 
00D-4774-AN
流動相 A 相：0.1% 甲酸水溶液；
流動相 B 相：0.1% 甲酸乙腈溶液,；
流速：0.3 mL/min,；
柱溫：40 ℃；
質(zhì)譜條件
質(zhì)譜型號：SCIEX Triple Quad™ 6500系統(tǒng)
離子源類型：電噴霧離子源（ESI+）
掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測正負(fù)離子模式（MRM）
為獲得較好的穩(wěn)定性和靈敏度,，優(yōu)化源氣參數(shù)及各化合物監(jiān)測離子對,、去簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE）。
靈敏度和線性
用 DS-8201 配制基質(zhì)曲線,，該方法曲線濃度范圍為 0.6nM~600nM,，經(jīng)過前處理后上機(jī)檢測，得到總抗體和結(jié)合型 Payload 線性良好,，R2 均大于 0.995（見下圖 4,、5）。
圖 4. 總抗特征肽標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖 5. Payload標(biāo)準(zhǔn)曲線
進(jìn)樣曲線最高點(diǎn)后進(jìn)空白溶液,，總抗體定量肽段殘留在 0.09‰,，小分子 payload 殘留在 0.14‰。兩者殘留均小于 LLOQ,，滿足分析要求,，LLOQ 和殘留色譜圖見圖 6~9。
圖 6. 總抗特征肽 LLOQ 定量離子色譜圖
圖 7. 特征肽殘留 XIC 色譜圖
圖 8. 結(jié)合型 payloadLLOQ 定量離子色譜圖
圖 9. Payload 空白殘留 XIC 色譜圖
方法回收率和基質(zhì)效應(yīng)
分別在大鼠血漿中添加低,、中,、高三個(gè)濃度 DS-8201 標(biāo)品，外標(biāo)法考察 MagBeads 的提取凈化回收情況見下表,，回收率均在 75%~90% 間,。通過對比空白基質(zhì)溶液添加酶解標(biāo)液和空白溶劑添加酶解后標(biāo)液，評估提取后基質(zhì)效應(yīng)得到,，基質(zhì)效應(yīng)為 96.5%,，可以得到血漿樣本通過 MagBeads 提取凈化后基本上沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。
表 1. 加標(biāo)回收結(jié)果
化合物 | 加標(biāo)濃度 nM | 回收率 % |
GPSVFPLAPSSK | 1.8 | 80.2% |
180 | 82.4% | |
600 | 86.8% | |
Dxd | 1.8 | 77.3% |
180 | 82.6% | |
600 | 87.1% |
討論
對于測定的總抗體,、結(jié)合型載荷與 ADC 的生物轉(zhuǎn)化,，一般采用將生物基質(zhì)中的所有 ADC 大分子免疫捕獲出來，再進(jìn)行后續(xù)酶解處理的方法,。本文選擇的使用通用型人源二抗對 ADC 藥物進(jìn)行提取捕獲,。根據(jù) ADC 濃度、基質(zhì)復(fù)雜程度以及其他檢項(xiàng)的需要,，還可以選擇抗載荷抗體與鏈霉親和素結(jié)合對偶聯(lián)抗體進(jìn)行捕獲,，從而更加提高方法的特異性和靈敏度。
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