原文作者– Helen Whitby, PhD
翻譯作者- Kevin Zhao, M.S., MBA
緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿（或弱堿及其共軛酸）所組成的緩沖對配制的,，且能夠在加入少量強酸或強堿時，可以有效減緩pH值改變的水溶液,。緩沖溶液能幫助維持分析方法的穩(wěn)定,，而不會因為微弱的環(huán)境改變的情況下而造成分析結果的改變。
緩沖溶液是被用來維持pH值的穩(wěn)定,。它們是通過維持弱酸及其共軛堿的平衡從而防止了pH值的改變,。
緩沖溶液是如何工作的？
根據(jù)Le Chatelier原理,，當一些強酸 (或者更多的氫離子“H+") 加入到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時,，平衡會被向左移動。同樣,，如果在混合物中加入強堿,，氫離子濃度下降的幅度會小于所預期加入堿的量。
當配制緩沖溶液時你應該遵循以下幾個原則
在配制緩沖液前,，建議用定值校準緩沖液標準品來校對電子pH計
根據(jù)所需緩沖液的濃度,，精確地稱出所需緩沖鹽的重量
把所需的緩沖鹽加到已經(jīng)裝有HPLC色譜級超純水的容量燒瓶中，并充分攪拌至溶解
使用pH探針或pH計去測量溶液的pH值
通過添加少量的強酸或強堿,，將容液的pH值調(diào)整至所需的值
調(diào)整至所需pH值后,，將溶液用色譜級超純水稀釋至最終的所需體積容量，并混合均勻
HPLC緩沖液通常用于控制在液相色譜分析中所不希望出現(xiàn)的二次相互作用。此外,，緩沖液也被用來工作分析物的電離狀態(tài),，以確保分析物不會同時出現(xiàn)一個以上的電離狀態(tài)。
化合物的pKa值代表此化合物的50%離子化和50%中性時的pH值,。如果在此pH值下分析此化合物,，你會看到分裂峰的出現(xiàn)或者不穩(wěn)定的保留時間。因此,，我們建議所有的分析方法的pH值都應該控制在目標分析化合物的pKa值正負兩個pH單位以上,。
當配制等度流動相的時候，我們還需要考慮以下幾個因素來確保方法的穩(wěn)定
盡可能提前預混合你所使用的流動相,，因為這將防止經(jīng)過泵混合流動相時會出現(xiàn)的錯誤
每一次都需要始終使用相同的配制方法及流程,。例如，如果你方法是先加水,，那你每次都必須是先加水,。如果你是先測定單獨的成分然后再混合，那你就必須每次都按這個流程來做,。記得千萬不要改變這一個固定的配制流程,，因為這個配制流程的改變讓分析物的保留時間可能出現(xiàn)很大的改變
以下的這個實驗例子展示了當流動相用以下不同的方式來混合時，峰保留時間可能出現(xiàn)的改變
方法一
先加水：先用量筒量400毫升的水并倒進1升的容量瓶中,，然后用甲醇稀釋至容量瓶的刻度
方法二
先加甲醇：先用量筒量600毫升的甲醇并倒進1升的容量瓶中，然后用水稀釋至容量瓶的刻度
方法三
甲醇和水各自先量好：先用量筒量600毫升的甲醇并倒進流動相瓶中,，然后用同樣的量筒量400毫升的水并倒進已經(jīng)裝有甲醇的流動相瓶中
方法四
讓液相的泵來混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇
緩沖液的濃度也是很重要的,。我們一般認為，10mM以下的濃度不足夠提供可以控制化合物硅醇活性或者電離狀態(tài)所需要的緩沖能力,，因此10mM是反相或者HILIC色譜模式下的低有效濃度,。對于其他色譜模式，如體積排阻色譜就需要更高的緩沖液濃度,，使用超過100mM濃度的緩沖液在體積排阻色譜法中并不罕見,。
緩沖液的濃度必須非常精確地平衡好，以確保在所有的條件下都能達到溶解,。在反相條件下,，如果方法條件是包含了高比例有機相的話（例如跨度很大的梯度），則很有可能需要控制緩沖液的濃度,，以確保不會出現(xiàn)緩沖鹽的析出,。
當開發(fā)一個可靠穩(wěn)定的HPLC方法時，流動相的貢獻跟色譜柱固定相的選擇性一樣重要,，另外流動相的選擇與配制跟色譜柱固定相批次間的質(zhì)檢也是一樣重要的,。
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