酶聯(lián)斑點(diǎn)（Elispot）實(shí)驗(yàn)服務(wù)

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 技術(shù)概述：

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)，英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù)),， 能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況,。其技術(shù)原理，一句話(huà)概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái),。

1、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作

(1)設(shè)備與耗材:

①超凈工作臺(tái);

②5% CO2 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱;

③P20,，P200,， P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20，P200,， P1000 槍頭;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管,。

(2)溶液配制

①PBS:用分析純?cè)噭琈illipore級(jí)別的純水配制,， 高壓滅菌,。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無(wú)菌操作。儲(chǔ)存于20-25°C, 可存放一個(gè)月,。

③70%乙醇:分析純乙醇70mL,，加入Millipore級(jí)別的純水至100mL。

④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級(jí)別的純水至100mL.

⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說(shuō)明書(shū),，加入雙蒸水溶解,。使用時(shí)，用PBS稀釋50倍,，每孔50uL,。

⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲(chǔ)液(Blocking stock solution R)稀釋10倍，每孔200uL,。

⑦抗體稀釋液:注意,，只是用來(lái)稀釋檢測(cè)抗體和酶聯(lián)親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲(chǔ)液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍

⑧檢測(cè)抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說(shuō)明書(shū),， 加入雙蒸水溶解,。使用時(shí)，用抗體稀釋液稀釋100倍,，每孔100uL,。

⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說(shuō)明書(shū)，加入雙蒸水溶解,。使用時(shí),，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100uL,。

D AEC顯色液: 照U-Cytech說(shuō)明書(shū),， 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲(chǔ)存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝，-200C保存,。

使用時(shí),，解凍，每孔加入100pL.

①PHA刺激物:將儲(chǔ)存液(2mg/ml,，Murex)分裝成20μL/EP管,， -20*C長(zhǎng)期凍存。 使用時(shí),，加入980μLU-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL,，10倍終濃度),，每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。

②U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基:我們推薦無(wú)血清ELISPOT技術(shù),，它能排除血清的干擾,，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好。如果沒(méi)有,，可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替,。

2、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計(jì)好試驗(yàn),，把每個(gè)孔要加入的內(nèi)容做成卡片,，到時(shí)候就會(huì)從容很多。每孔加入15μL 70%的醇預(yù)濕30秒,。

注意:

①未潤(rùn)濕的PVDF膜是潔白的,、不透明的，經(jīng)過(guò)乙醇潤(rùn)濕之后,，顏色變暗,，變成半透明狀，很容易觀(guān)察二者的區(qū)別,。

②加乙醇的時(shí)候,，槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不到刺到PVDF膜,。

③有時(shí)候，加入的乙醇掛在孔壁上,， 這時(shí)要蓋上板蓋,，輕輕叩擊，讓乙醇順勢(shì)滑落,。乙醇一 旦接觸到PVDF膜,，就會(huì)在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤(rùn)整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化,。

④15μL 是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的體積,，它能保證剛好*浸潤(rùn)整塊膜，而不會(huì)有剩余,。如果加大使用量,，乙醇溶液就會(huì)透過(guò)膜而積存在膜的背面,加深實(shí)驗(yàn)的背景。

⑤加入100μL去離子水洗滌三次,，盡量減少乙醇的殘留,。

⑥按照試劑盒的使用說(shuō)明，將包被抗體儲(chǔ)存液稀釋在PBS緩沖液中,，每孔加入50μL,，4°C包被過(guò)夜,。

⑦(次日)傾倒包被液，用PBS洗滌5次,，后一次,，在滅菌的吸水紙上扣干。

⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,，37°C封閉1小時(shí),。

⑨傾倒封閉液，無(wú)須洗滌,，直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口，4°C保存,，可以在4°C保存數(shù)周,。)

(2)第二天:鋪細(xì)胞，加入刺激物,，培養(yǎng)

①整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置-組正對(duì)照(PHA刺激), 每一個(gè)細(xì)胞樣品(同-個(gè)捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)要設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照

(不加刺激物),，整塊板還要加一個(gè)背景負(fù)對(duì)照(不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑),。

②填好實(shí)驗(yàn)卡片,，用以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個(gè)細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)(想要有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義,，每個(gè)細(xì)胞/刺激物設(shè)4個(gè)孔的重復(fù)),。

④取出封閉好的板，準(zhǔn)備加入細(xì)胞,。如果是以前做的封閉,，可以加入200μL 的U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘，傾倒,，然后再重復(fù)- -次,。

⑤按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排，加入不同濃度的細(xì)胞,，100uLwell, 細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入

細(xì)胞之后,，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞更分散,，實(shí)際情況剛好相反),。正對(duì)照的細(xì)胞濃度為1x105/well,實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請(qǐng)自行調(diào)整。

⑥加入100μL的U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對(duì)照孔,。

⑦正對(duì)照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌,。

⑧加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物(配制成10X終濃度，10uLwell)到實(shí)驗(yàn)孔,。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板,。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓刺激物在孔中混合均勻,，實(shí)際上，通過(guò)擴(kuò)散,，刺激物也會(huì)很快混合均勻,。拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞成圈的分布在孔的外周。

⑨當(dāng)加完所有的樣品之后,，蓋上板蓋,，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24小時(shí),。 注意在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)

程中避免移動(dòng),、碰撞培養(yǎng)板。為了取得更好的結(jié)果,，甚至開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱的箱[ ]也應(yīng)該禁止,。因?yàn)榕鲎矔?huì)造成細(xì)胞的移位，造成斑點(diǎn)的模糊,、拖尾,。

(3)第三天:培養(yǎng)后操作

①傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。

②低滲法將細(xì)胞裂解,，每孔加入200μL冰冷的去離子水,，將板置于冰上冰浴10分鐘。

③每孔用200μLPBST洗滌10遍,，洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干,。

④按照試劑盒說(shuō)明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測(cè)抗體,，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體,37°C 1小時(shí),。

⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍，洗滌后一遍時(shí),， 將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面,，蓋上保護(hù)層,，將板倒扣在吸水紙上拍干。

注意:

①洗滌膜的背面,，我們摸索出的辦法是,，在-個(gè)淺托盤(pán)中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可,。注意,，-定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再合攏,，蓋上,，不要傷害到膜,。

②按照試劑盒說(shuō)明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素,，每孔加入100L, 37°C 1小時(shí),。

③每孔用200μL PBST洗滌5遍， 洗滌后-遍時(shí),，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層,，將板倒扣在吸水紙上拍干,。

④照試劑盒的說(shuō)明，解凍已配好的AEC顯色液,。每孔加入100μL的顯色液,，室溫靜置20-30分鐘，注意避光,。

⑤待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后,，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過(guò)程,。將板倒扣在吸水紙上,拍干細(xì)小的水珠,，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方,，室溫靜置10-30分鐘,，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi),，防止膜發(fā)脆,、破裂。

⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù),，半點(diǎn)計(jì)數(shù),并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù),，作統(tǒng)計(jì)分析。

酶聯(lián)免疫（ELISA）技術(shù)服務(wù)

實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)