【嘉美生物】In situ cell death detection kit-POD法

一、 原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下,，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端,，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合,，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色）,，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞,；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂,，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色,。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋,、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評價,，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段,。

二、 器材與試劑
器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng),、小型染色缸,、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜,、吸管,、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；
試劑：試劑盒含TdT 10×,、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×,、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS,、雙蒸水、二甲苯,、梯度乙醇（100,、95、90,、80,、70%）、DAB工作液（臨用前配制,，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）,、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,，臨用前配制）,、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,，pH 7.5,， 10 mM MgCl2,，1 mg/ml BSA）等。

三,、 實(shí)驗步驟
操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟,、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計數(shù)并拍照。
具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：
1. 用二甲苯浸洗2次,，每次5min,；
2. 用梯度乙醇（100、95,、90,、80、70%）各浸洗1次,，每次3min,；
注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理
4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時間,、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min,；
5. PBS漂洗2次；
6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液,，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻,；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1,，反應(yīng)在15~25℃×10min,，后面步驟同處理組。
7. 玻片干后,，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上,，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。
8. PBS漂洗3次,；
9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長為450~500nm,，檢測波長為515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上,，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min,。
11. PBS漂洗3次；
12. 在組織處加50~100μlDAB底物,，反應(yīng)15~25℃×10min,；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染,，幾秒后立即用自來水沖洗,。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,。
15. 加一滴PBS或甘油在視野下,，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計200~500個細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小,，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體,，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮,、變圓、脫落,；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮,、邊緣化，核膜裂解,，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）
對于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：
①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4）,，干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存,；
②適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,，同時設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組，各組離心收集約1×106個細(xì)胞,，PBS洗一次,，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上,，自然干燥,，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；
③將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min,；
④PBS浸洗二次,，每次5min；
⑤將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見備注5）中處理5min,；
⑥PBS浸洗二次,，每次5min；
后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6—15

四,、 注意事項
1. 進(jìn)行PBS 清洗時，每次清洗5 min,。
2. PBS清洗后,，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng),。
3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗用反應(yīng)液后,，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體,，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗失敗,。
4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時間在冰上保存,。不宜*保存,，*保存會導(dǎo)酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,，則不可使用,，需重新配制。
6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸* PH4.0）染色后,，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠,。然后進(jìn)行洗凈（*乙醇）、脫水（二甲苯）透明,、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作,。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色,，注意快速進(jìn)行脫水操作,。
7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入,、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體,，注意防護(hù)。
8. 試劑保存,；未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）,；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下,，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定,，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后,，放至冰上直至使用,。
9. 結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽性結(jié)果,；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

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