KO first小鼠模型構(gòu)建方法及應用

1. 構(gòu)建方法

KO first（Conditional Ready）小鼠模型是一種多用途的基因敲除模型,，通過在目的基因的特定位置插入特定的重組位點（如LoxP和FRT），實現(xiàn)全基因敲除或條件性基因敲除,。以下是構(gòu)建KO first小鼠模型的主要步驟：

設計靶向載體：在目的基因的外顯子兩側(cè)插入方向相同的LoxP位點,，并在靶片段5’端內(nèi)含子中插入一個帶有FRT位點的SA-IRES-reporter片段。這個片段包含一個報告基因（如GFP）和一個抗性基因（如Neo）,。

構(gòu)建Flox小鼠：通過同源重組技術(shù),，將靶向載體導入胚胎干細胞（ES細胞）中，然后將這些細胞注射到囊胚中,，形成嵌合體小鼠,。通過交配，獲得攜帶LoxP位點的Flox小鼠,。

全基因敲除：將Flox小鼠與全身表達Cre的小鼠交配,，Cre重組酶會識別LoxP位點并切除目標基因，同時保留報告基因和抗性基因,，得到全基因敲除的小鼠,。

條件性基因敲除：將Flox小鼠與Flp工具鼠交配，F(xiàn)lp重組酶會識別FRT位點并切除SA-IRES-reporter片段,，得到常規(guī)的Flox小鼠,。然后將Flox小鼠與組織特異性的Cre工具鼠交配，實現(xiàn)條件性基因敲除,。

2. 基因型鑒定

PCR鑒定：通過設計特異性引物，對小鼠基因組DNA進行PCR擴增,，檢測LoxP位點,、FRT位點、報告基因和抗性基因的存在,。

Southern blotting：通過限制性酶切和探針雜交,，檢測基因整合情況和敲除情況,。

3. 應用

KO first小鼠模型具有廣泛的應用，主要包括以下幾個方面：

研究基因功能：通過全基因敲除或條件性基因敲除,，研究基因在特定組織或發(fā)育階段的功能,。

疾病模型構(gòu)建：模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展，研究疾病機制,。例如,，通過敲除腫瘤抑制基因構(gòu)建腫瘤模型。

藥物篩選和驗證：評估藥物的療效和安全性,，驗證藥物靶點的有效性,。

基因表達示蹤：通過報告基因的表達，示蹤目標基因的表達情況,，方便基因研究,。

4. 優(yōu)勢與局限性

優(yōu)勢：

多用途：既可以實現(xiàn)全基因敲除，也可以實現(xiàn)條件性基因敲除,。

靈活性：通過選擇不同的Cre和Flp工具鼠,，可以靈活地控制基因敲除的時間和空間。

局限性：

設計復雜：需要對基因進行全面分析,，避免基因敲除導致內(nèi)源性基因表達下調(diào)或截短蛋白的表達,。

周期較長：構(gòu)建過程涉及多個步驟，包括ES細胞打靶,、嵌合體小鼠的獲得和交配等,，整個過程可能需要9-12個月。