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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠終板軟骨采用膠原酶 - 蛋白酶聯(lián)合消化并結(jié)合軟骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠終板軟骨經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

小鼠終板軟骨細(xì)胞分離自椎間盤終板軟骨組織,；椎體終板是椎體在生長(zhǎng)發(fā)育過程中,，椎體上下面的骨骺板骨化停止后形成骨板，呈輕度凹陷,，即為骨性終板,。椎體終板的中央仍為一薄層透明軟骨覆蓋，并終生存在,，即為軟骨終板,，上下軟骨終板與髓核和纖維環(huán)連接共同構(gòu)成椎間盤。椎體終板構(gòu)成了椎間盤的上下邊界,，位于椎體中心的松質(zhì)骨和椎間盤之間,。是由軟骨下骨和厚度相當(dāng)?shù)母采w其上的軟骨組成。主要作用是防止椎間盤髓核組織嵌入椎體,，同時(shí)具有平衡分散應(yīng)力的作用,。成熟的終板軟骨細(xì)胞多2-8個(gè)成群分布于軟骨陷窩內(nèi),，這些終板軟骨細(xì)胞由同一個(gè)母細(xì)胞分裂增殖而成，稱為同源細(xì)胞群,。電鏡下,，終板軟骨細(xì)胞有突起和皺褶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體,。在組織切片中,，終板軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙,。體外培養(yǎng)的終板軟骨細(xì)胞對(duì)于研究其生理功能,、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

培養(yǎng)信息：

包被條件：

培養(yǎng)基：含FBS,、EGF,、Insulin、Transferrin,、Selenium Solution,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每3-4天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：梭形,、多角形

傳代特性：可傳2-3代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

小鼠終板軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。