通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒

通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體

目錄號：42015

試劑盒組成、儲存,、穩(wěn)定性：

儲存：-20 ℃ 保存,。

產(chǎn)品介紹：

菌落PCR鑒定是T載體克隆連接后鑒定是否有陽性克隆（含插入片段）zui方便快捷的方法,。但是市面上能見到的菌落PCR鑒定試劑盒采用的都是T3,T7或者SP6等特異T載體引物,，只能用于某種特定T載體連接陽性克隆的鑒定。如果使用不同T載體,，便需同時購買多種鑒定試劑盒,，大大增加了使用成本。本公司采用通用T載體引物研制的通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒,，只需購買一種試劑盒,，便可用于市面上所有常見的T載體(包括pGEM，pUC,，pBluescript系列) 連接陽性克隆的鑒定,。此外,，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鑒定試劑盒引物距離插入位點的距離非常短，因此在鑒定100bp左右或者更小片段的插入時,，陰性克隆的引物二聚體條帶和陽性克隆擴增條帶大小接近,，無法區(qū)分。往往把引物二聚體的條帶看成是陽性擴增條帶,，造成假陽性,。反之，造成假陰性,。本試劑盒通用T載體引物在未插入片段時的距離至少有150bp以上,，加上插入片段的長度，可以清晰的區(qū)分是插入片段擴增出的條帶還是引物二聚體擴增出的條帶,。避免假陽性或者假陰性,，大大提高了準確性。本公司研發(fā)的一管便攜式PCR MasterMix預混系統(tǒng),，無需您一一加入各種成分,，直接加入需篩選單菌落，經(jīng)過1小時左右的PCR反應和電泳檢測即可得到重組菌落鑒定的結(jié)果,。

預期擴增片段：

注意事項：

1.        重組菌落鑒定時,，挑取單菌落前，應先做好標記,，便于鑒定后使用,。

2.        挑取菌落時，應選擇單菌落,，不要挑取太多菌體,，以免影響PCR結(jié)果。

3.        設定PCR 程序時,，請根據(jù)插入片段大小決定延伸時間,，如果插入片段大小為1 kb 以下，延伸時間30-45 秒即可,，如果片段更長,，可按此比例增加延伸時間。

操作步驟（以25ml體系舉例,，客戶也可以采用20ml體系）：

{C}1.   按以下體系配好含有引物的1 x Taq MasterMix 反應液,。

2.  將過夜培養(yǎng)的平板上的菌落編號后，使用滅菌的槍頭挑取一部分單菌落加入上述反應液,，吹打混勻使菌落充分分散到反應液中,。

可多設置一管不加菌落的陰性對照，以便于分析實驗結(jié)果,。

3.  將PCR管置于熱循環(huán)儀上按以下條件開始反應,，建議條件如下：

94℃ 10 min

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec        30-33 cycles

72℃ 0.5-1 min

72℃ 5 min

注意：延伸時間請根據(jù)插入片段大小調(diào)整,。預變性時間延長到10分鐘，主要是為了裂解菌落,，釋放DNA模板,。

反應結(jié)束后，取5-10ml直接上樣電泳檢測,。

注：如果細菌難裂解或者雜質(zhì)多假陰性,，嘗試下面的方法，裂解釋放DNA后進行,。

1.        挑取菌落加入 50ml dd水 （或者10ml dd水中）,，振搖。

2.        99度,，10分鐘滅活菌液中的酶,，并釋放DNA,。

3.        12000rpm離心1分鐘去除細胞碎片,。

4.        取上清PCR，25ml PCR體系取5ml上清（起始50ml dd水）,，或者1ml上清（起始10ml dd水）做模板,。

通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體