NADH 氧化酶（NADH oxidase,，NOX）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，可在氧氣存在下,，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD 的再生,，而且與免疫反應密切相關,。

測定原理：

NOX 能夠將NADH 氧化為NAD，NADH 的氧化與 2,6 二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯,，藍色的DCPIP 被還原為無色的DCPIP,，在 600nm 下測定藍色DCPIP 的還原速率計算出NADH 氧化酶活性的大小。

NADH 氧化酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列

組成：

試劑五：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,；臨用前加入 5ml 蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融,。

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰,、蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿 600g,，4℃離心 5min,。

棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11100g，4℃離心 10min,。

上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10 秒，重復 30 次）,，用于NOX 活性測定,。

血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調節(jié)波長至 600nm，蒸餾水調零,。

2,、樣本測定

（1） 試劑四于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本,、200μl 試劑四和 40μl 試劑五,，混勻，記錄 600nm 處20s 時吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2,。

NOX 活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）NOX 活力的計算:

單位的定義：每ml 血清（漿）在每ml 反應體系中每分鐘A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/ml）＝ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2,、組織、細菌或細胞中 NOX 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白在每ml 反應體系中每分鐘A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織在每ml 反應體系中每分鐘A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在每 ml 反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，0.25ml,； V 樣：加入樣本體積，0.01ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml； T：反應時間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml,；W：樣本質量,；500：細胞或細菌總數，500 萬,。 b.使用 96 孔板測定的計算公式如下：

1,、血清（漿）NOX 活力的計算:

單位的定義：每ml 血清（漿）在每ml 反應體系中每分鐘A600 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T=5000×ΔA

2,、組織,、細菌或細胞中 NOX 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白在每ml 反應體系中每分鐘A600 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織在每ml 反應體系中每分鐘A600 變化 0.005 定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在每ml 反應體系中每分鐘 A600 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，0.25ml,； V 樣：加入樣本體積，0.01ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml； T：反應時間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml,；W：樣本質量,；500：細胞或細菌總數，500 萬,。

NADH 氧化酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列