檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶,，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一,。

測(cè)定原理：

CS 催化乙酰CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔mei A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,，在 412nm 處有特征吸光值,。

檸檬酸合酶試劑盒 輔酶Ⅰ系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存,，臨用前加入 1.2ml 蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽、冰,、無水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。將勻漿 600g，4℃離心 5min,。

棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心 10min,。

上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）,。

在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3秒,，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）,，用于線粒體CS 測(cè)定,。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、樣本測(cè)定

（1） 在試劑五中加入 0.6ml 無水乙醇和 13ml 試劑四,，混勻,，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

（2） 測(cè)定管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、220μl 試劑五和 10μl 試劑六,，混勻,，37℃反應(yīng) 15min 后立即測(cè)定吸光值A1。

（3） 對(duì)照管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本,、220μl 試劑四和 10μl 試劑六,，混勻，37℃反應(yīng) 15min 后立即測(cè)定吸光值A2,。

（4） 計(jì)算ΔA=A1-A2,，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CS 活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位,。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=23.8×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.0475×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.4×10^-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間,，15 min,；Cpr：樣本 蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn),。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=47.5×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.095×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L,；ε：TNB 摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96 孔板光徑,，0.5cm,； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間,，15 min,；Cpr：樣本 蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn),。

檸檬酸合酶試劑盒 輔酶Ⅰ系列-常備現(xiàn)貨