NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI,，Live/Dead Cell Double Stain Kit

產(chǎn)品貨號：CA9418

產(chǎn)品名稱：Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

英文名稱：Calcein-AM/PI,，Live/Dead Cell Double Stain Kit

產(chǎn)品規(guī)格：500T

Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒檢測

產(chǎn)品簡介：

儲存條件：-20℃,，避光，有效期1年,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI,，Live/Dead Cell Double Stain Kit是一種對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm,Em=515nm）,。因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入yi酰甲氧基甲酯（AM）基團,，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜,。一旦進入細胞后,，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光,。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比,，由于Calcein,AM細胞毒性極低,，是最shi合用于活細胞染色的熒光探針,，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性,。

由于死細胞缺乏酯酶,，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此,，Calcein-AM 常常與死細胞熒光探針如碘化bing啶（PI）等聯(lián)合使用,，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化bing啶（Propidiumiodide,，PI）不能穿過活細胞的細胞膜,，僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核,，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535nm,Em=617nm），因此PI 僅對死細胞染色,。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā),，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545nm激發(fā),，僅可觀察到死細胞,。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標(biāo)記,，從而進行活細胞和死細胞水平的分析,。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系，單次就100µL細胞懸液進行染色,，可以做500次檢測,。

使用方法（僅供參考）：

1. 工作液的前處理

(1) 從低溫冰箱內(nèi)取出10×AssayBuffer，根據(jù)單次用量無菌條件取出適量,，用去離子水10倍稀釋以得到1×AssayBuffer,。

(2) 由于Calcein-AM 的穩(wěn)定性受溫度影響較大，建議收到貨后,，可分裝為小份,，密封避光保存于-20℃，不能反復(fù)凍融,。若染色液經(jīng)稀釋,，建議當(dāng)天用完。

2. 細胞處理

(1) 懸浮生長的細胞,，收集至離心管,，450g ，離心5min,，去除上清,。用1x的AssayBuffer洗滌細胞，450g,，離心5min,，2次，去除殘留酯酶,。

(2) 貼壁細胞經(jīng)0.25%yi酶-EDTA消化后,，收集細胞，用1x的AssayBuffer洗滌細胞,，450g,，離心5min，2次，去除yi酶及殘留的酯酶,。

3. 染色步驟

(1) 離心得到的細胞沉淀用1×AssayBuffer重懸,，使重懸后細胞懸液計數(shù)細胞量為1×105~6個/ml。

(2) 每1ml的細胞量加入1-2ul的Calcein-AM（原液）,，吹打混勻,，37℃避光孵育 20min-25min。

(3) 將試劑盒自帶的PI原液取3-5ul加入上述染色細胞中,，室溫避光染色5min,。

(4) 孵育熒光后的細胞，450g,，5min,，離心去除染色液。

注：細胞進行熒光染色時建議全程避光,。

(5) 用1x的PBS清洗細胞450g,，5min，離心后用1xPBS重懸細胞,，取3-5ul滴在潔凈的載玻片上,，用干凈的蓋玻片壓片后，請及時熒光鏡檢,。

(6)  熒光顯微鏡下使用490±10nm激發(fā)濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）,。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞,。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進行檢測,。

注意事項：

(1) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

(2) 貼壁細胞也可以不消化,，直接去除培養(yǎng)基，經(jīng)1×AssayBuffer浸洗2min,，2次,。按上述細胞量和染色液濃度比例進行染色，染色時間和染色液工作濃度可按實際檢測調(diào)整,。

(3) Calcein-AM 作用于細胞,，一般細胞量在1×105-6個時，Calcein-AM的工作濃度基本在2-4µM（如遇鏡檢熒光亮度過強,，稀釋比例可適當(dāng)調(diào)整在1:500到1:2000或更大）,；PI的工作濃度在5µM左右。但由于不同細胞系的優(yōu)良染色條件不同,，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度,。梯度篩選的原則為使用最di的探針濃度得到最hao的熒光結(jié)果,。

(4) 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性,，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚,，需要立即用自來水清洗,。

注：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料針對不同細胞的優(yōu)良工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細胞10min,，或者用70%乙醇孵育細胞30min,，從而制備死細胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液進行死細胞染色,，以得到僅僅對細胞核染色,，而不會對細胞質(zhì)染色的優(yōu)良工作濃度。

c) 用0.1-10µM 的Calcein-AM 進行死細胞染色,，以得到不會對細胞質(zhì)染色的優(yōu)良工作濃度,。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色,。

Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒檢測 

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CA9418 Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI,，Live/Dead Cell Double Stain Kit  500T