小鼠嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)ELISA試劑盒檢測原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被顆粒酶B（Gzms-B）抗體的包被微孔中,，依次加入標本、標準品,、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的顆粒酶B（Gzms-B）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。  

樣品收集,、處理及保存方法：  

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。  

2.血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。  

3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。  

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。  

5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。  

自備物品  

酶標儀（450nm）  

高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL  

37℃恒溫箱  

小鼠嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)ELISA試劑盒操作注意事項：  

試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用,。  

實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。  

濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白,；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍,，最終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度,。  

嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作,。  

所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成：

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0,、1,、2、4、8,、16pg/mL,。  

試劑的準備：  

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。  

洗板方法：  

手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。  

自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5次,。  

操作步驟：  

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。  

設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,。 

樣本孔先加待測樣本10μL，再加40μL,；空白孔不加,。  

除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。  

棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）,。  

每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min。  

每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。  

結(jié)果判斷： 

繪制標準曲線：在Excel工作表中,，以標準品濃度作橫坐標,，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值,。  

試劑盒性能：  

準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900,。  

靈敏度：檢測濃度小于0.1pg/mL,。  

特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。  

重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。  

貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。  

有效期：6個月,。