高級(jí)磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）分析原理：
磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）檢測(cè)試劑盒用于測(cè)量在 Thr202/Tyr204 位點(diǎn)磷酸化的 ERK。與蛋白質(zhì)印跡法不同,，該檢測(cè)基于微孔板,，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜,。磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）檢測(cè)使用兩種標(biāo)記抗體：一種帶有供體熒光團(tuán),，另一種帶有受體。第一種抗體因其對(duì)蛋白質(zhì)上磷酸化基序的特異性結(jié)合而被選擇,，第二種抗體因其能夠識(shí)別不依賴(lài)于其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力而被選擇,。蛋白質(zhì)磷酸化使得涉及兩種標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物形成，并使供體熒光團(tuán)靠近受體,，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號(hào),。其強(qiáng)度與樣品中磷酸化蛋白的濃度直接成正比,，并提供了一種在無(wú)需洗滌的檢測(cè)形式下評(píng)估蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法,。

高級(jí)磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）雙板檢測(cè)方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后裂解,，再將裂解液轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測(cè)板中,，然后加入磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）HTRF 檢測(cè)試劑。該方案能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞的活力和融合度,。

高級(jí)磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）單板檢測(cè)方案：
使用 HTRF 試劑檢測(cè)磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）可以在用于培養(yǎng),、刺激和裂解的單板上進(jìn)行。無(wú)需洗滌步驟,。這種為高通量篩選設(shè)計(jì)的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化,，同時(shí)保持穩(wěn)健的 HTRF 質(zhì)量。

分析驗(yàn)證：

與蛋白質(zhì)印跡法相比,，高級(jí)磷酸化 ERK 具有靈敏度。

在 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時(shí)后,，用 50nM EGF 刺激 5 分鐘,。去除培養(yǎng)基并裂解后，收集細(xì)胞裂解液并離心 10 分鐘,。進(jìn)行系列稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)印跡法和 HTRF 高級(jí)磷酸化 ERK 并行分析,。使用 HTRF 高級(jí)磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）時(shí)，僅需 300 個(gè)細(xì)胞即可檢測(cè)到最小信號(hào),，而蛋白質(zhì)印跡法則需要 10,000 個(gè)細(xì)胞才能產(chǎn)生信號(hào),。HTRF 高級(jí)磷酸化 ERK 檢測(cè)至少比蛋白質(zhì)印跡法靈敏 30 倍，并且顯示出最佳的相關(guān)性,。

無(wú)需刺激即可對(duì)抑制劑的基礎(chǔ)磷酸化 ERK 進(jìn)行劑量反應(yīng),。

高級(jí)磷酸化 ERK 能夠研究 MAPK 通路抑制劑化合物在基礎(chǔ)激活水平上的作用，無(wú)需通路刺激,。由于其高交叉反應(yīng)性,，高級(jí)磷酸化 ERK 與許多不同的模型物種高度兼容：人、小鼠,、大鼠,、狗,、猴、倉(cāng)鼠,、貂,、牛、豬,、果蠅和斑馬魚(yú),。所有實(shí)驗(yàn)均使用貼壁細(xì)胞的雙板檢測(cè)方案進(jìn)行。接種一天后,，所有細(xì)胞系在 37°C,、5% CO?下用相應(yīng)的抑制劑處理 30 分鐘。

磷酸化 ERK 在糖尿病模型和患者血細(xì)胞中的調(diào)節(jié)

高級(jí)磷酸化 ERK 檢測(cè)試劑盒非常適合監(jiān)測(cè)胰腺 β 細(xì)胞系或患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中的激動(dòng)劑刺激,。實(shí)驗(yàn)在兩種胰腺 β 細(xì)胞系 Ins-1E 和 Min6 上進(jìn)行,。使用雙板檢測(cè)方案。兩種細(xì)胞系均以 70,000 個(gè)細(xì)胞 / 孔的密度接種 4 天,。細(xì)胞洗滌后,，用不含葡萄糖的 Krebs Ringer 緩沖液孵育。饑餓 2 小時(shí)后,，用葡萄糖刺激細(xì)胞,。將 PBMC 以 100,000 個(gè)細(xì)胞 / 孔的密度分配，然后在 37°C,、5% CO?下用佛波酯（PMA）刺激 30 分鐘,。

腫瘤異種移植中靈敏的磷酸化 ERK 檢測(cè)。

從裸鼠中切除 BxPC-3 胰腺腫瘤異種移植組織,，研磨并裂解,。離心后，收集可溶性部分并進(jìn)行系列稀釋?zhuān)缓笥?HTRF 高級(jí)磷酸化 ERK 試劑盒試劑進(jìn)行檢測(cè),。

優(yōu)化用于磷酸化 ERK 檢測(cè)的細(xì)胞密度,。

由于高級(jí)磷酸化 ERK 的高靈敏度，當(dāng)預(yù)期 ERK 磷酸化水平較高時(shí),，建議使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的低細(xì)胞密度,，以確保在試劑盒的線(xiàn)性范圍內(nèi)操作并實(shí)現(xiàn)最佳的信號(hào) / 背景比（S/B）。使用貼壁細(xì)胞的雙板檢測(cè)方案,，在 HEK293 細(xì)胞上用 EGFR 激動(dòng)劑 EGF 或小分子 Raf 激酶抑制劑 L779 - 450 進(jìn)行劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn),。細(xì)胞以 25,000、50,000 或 100,000 個(gè)細(xì)胞 / 孔的密度在 37°C,、5% CO?下接種 24 小時(shí),。

Gαq/i 偶聯(lián)受體激活。

使用磷酸化 ERK 細(xì)胞檢測(cè)的雙板檢測(cè)方案,，在 CHO - CCR5（25,000 個(gè)細(xì)胞）上用 Rantes 和 MIP - I? 激活 10 分鐘獲得的結(jié)果,。

篩選魯棒性,。

在室溫下用卡巴刺激 CHO - M1（5,000 個(gè)細(xì)胞 / 孔 - 384 孔小體積板）10 分鐘。在五十次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中,，計(jì)算未刺激細(xì)胞（基礎(chǔ)水平）和兩個(gè)選定的卡巴濃度（1.3μM 和 4μM,，分別對(duì)應(yīng)于 EC80 和 EC100）之間的 Z' 值。使用磷酸化 ERK 試劑盒的單板檢測(cè)方案在來(lái)自 CyBio™的機(jī)器人系統(tǒng)（配備 384/25μL 移液頭的 CyBivario）上進(jìn)行檢測(cè),。結(jié)果在 PHERAStar Plus（BMG Labtech）上讀取,。

總 ERK1/2 檢測(cè)以控制 ERK1/2 的磷酸化。

使用磷酸化 ERK1/2 和總 ERK1/2 檢測(cè)的雙板檢測(cè)方案,，用 EGF 激活 A431 細(xì)胞（100,000 個(gè)細(xì)胞 / 孔）10 分鐘。正如預(yù)期的那樣,，結(jié)果顯示在 EGF 刺激下 ERK1/2 磷酸化呈劑量反應(yīng)性增加,，而 ERK1/2 表達(dá)水平保持恒定。

簡(jiǎn)化的通路：

MAPK/ERK 細(xì)胞信號(hào)通路：

MAPK/ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)由參與生長(zhǎng)和分化的多種受體激活,。核心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)引發(fā)眾多細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié),，包括粘附、遷移,、凋亡,、分化和代謝。MEK1/2 在 Tyr204 和 Thr202 位點(diǎn)催化 ERK1/2 的磷酸化,。作為響應(yīng),，ERK 磷酸化數(shù)百種細(xì)胞質(zhì)和核底物。MAPK 信號(hào)的廣泛復(fù)雜性和多樣性使 ERK 成為生物學(xué)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和主要信號(hào)節(jié)點(diǎn),。

ERK 在 GPCR 信號(hào)通路中的作用：
ERK 調(diào)節(jié)在 GPCR 信號(hào)通路中起著重要作用,，因此是一個(gè)重要的可測(cè)量的 GPCR 讀出指標(biāo)。GPCR 通過(guò) G 蛋白作用調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞功能,。在刺激下,，這些受體激活效應(yīng)器如腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶 C，這不僅影響細(xì)胞內(nèi)第二信使如 cAMP 和 Ca2?的濃度,，還介導(dǎo) ERK1/2 磷酸化,。GPCR 也已被證明以不依賴(lài) G 蛋白但依賴(lài) β-arrestin 的方式介導(dǎo) ERK1/2 激活。