一,、BrainBits星形膠質(zhì)細(xì)胞全腦培養(yǎng)試劑盒內(nèi)容

該試劑盒內(nèi)含：1 E18小鼠全腦、12mL NbAstro,、6.2mg木瓜蛋白酶,、5mL HE-Ca 、1個帶橡膠球的火拋光移液,、1對PDL涂層蓋板

二,、BrainBits星形膠質(zhì)細(xì)胞全腦培養(yǎng)試劑盒產(chǎn)品簡介

該試劑盒包含從新鮮組織開始培養(yǎng)所需的一切。E18組織用2ml含B27的THRYVE胚胎儲存介質(zhì)運(yùn)送,。立即使用組織以獲得最高的細(xì)胞產(chǎn)量,，但組織可在4-8°C下保存一周。這個試劑盒是完mei的研究人員剛剛開始或?yàn)槟切┱l想要的可靠性,。非常適合課堂教育,，為下一代研究人員提供實(shí)踐方法。

三,、產(chǎn)品操作

（1）細(xì)胞分散（無菌操作箱中的室溫）

A,、用 2 毫升移液管小心地將組織轉(zhuǎn)移至木瓜蛋白酶中，盡量減少培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移,。將 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至一個新的無菌 15 毫升管中,，以備第三步使用。

B,、將組織和木瓜蛋白酶在30℃下孵育 10 分鐘,。每 2 分鐘輕輕攪拌一次，或者使用加熱振蕩板,，溫度為30℃,，轉(zhuǎn)速為 150 轉(zhuǎn)/分鐘。

C、用 2 毫升移液管從木瓜蛋白酶中取出含有少量培養(yǎng)基的組織,，并返回步驟 A中的 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基中,。

D、使用涂有硅油的巴斯德移液管,，研磨組織不超過 10 次,，或分散 90%的組織，避免產(chǎn)生氣泡,。

E,、讓未分散的顆粒靜置 1 分鐘?？蛇x：向細(xì)胞懸液中加入 400 微升 1 毫克/毫升的 DNase I 溶液,，并在室溫下孵育 15 分鐘，每 5 分鐘輕輕攪拌或搖晃試管,。

F,、將含有分散細(xì)胞的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌的 15 毫升管中。留下約 50 微升含有碎片的 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基,?？蛇x：通過 70 微米的細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞溶液。

G,、以 1100 轉(zhuǎn)/分（200×G）離心 1 分鐘,。棄去上清液，留下約 50 微升含有沉淀物的 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基,。

H,、分散細(xì)胞團(tuán)（用手指或試管輕彈管底），然后將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于 1 毫升的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（NbAstro™）中,。

I,、將 20 微升細(xì)胞溶液分裝到含有 80 微升臺盼藍(lán)（1:5 稀釋）的 0.5 毫升管中。

J,、使用血細(xì)胞ji數(shù)器（計算細(xì)胞/毫升）或采用當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)室程序來計數(shù)細(xì)胞,。 （2）細(xì)胞培養(yǎng)（無菌室中的室溫）

A、用 0.2 毫升/平方厘米的 NbAstro™ 稀釋細(xì)胞,，并以 7500 個細(xì)胞/平方厘米或期望的濃度進(jìn)行鋪板,。注意：以更高的密度鋪板會導(dǎo)致神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的混合。

B,、孵化時間37 ℃,、5%的二氧化碳2、9%的氧氣2,、95%的濕度（或環(huán)境濕度O2 )）

C,、 每 3 - 4 天用新鮮的,、37℃、二氧化碳平衡的 NbAstro 更換一半的培養(yǎng)基,。

D,、1.5 至 2 周后，星形膠質(zhì)細(xì)胞將有 90%融合,，準(zhǔn)備收獲或傳代,。

E、若要轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元培養(yǎng)物中：提前 24 小時,，將一半的培養(yǎng)基更換為 Neurobasal®/B27®/GlutaMAX™（NbActiv1™）,。

F、對于擴(kuò)增：用 0.25%胰蛋bai酶在 THRYVE 胚胎培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞,，(37 ℃,，5 分鐘）。

G,、若要抑制胰dan白酶,，請使用dan蛋白酶抑制劑或血清。

（3）活力測定：

A,、用 37 ℃平衡yan溶液（0.2 毫升/平方厘米底物）沖洗兩次,。

B,、從 15mg/ml 熒光素二乙酸酯的丙酮儲備液和 4.6mg/ml 碘化丙啶的水溶液儲備液中制備染色液,，將每種溶液稀釋 15 微升至 1.5 毫升的 HBSS 中（1:100 稀釋）。

C,、將步驟 B 中的 20 微升染料混合物添加到步驟A中添加的每 0.2 毫升的 HBSS 中（1:10 稀釋）,。

D、約 1 分鐘后,，使用適合熒光素?zé)晒獾乃{(lán)色激發(fā)來計數(shù)活細(xì)胞（綠色細(xì)胞）,。使用綠色激發(fā)來計數(shù)碘化丙啶熒光（小紅色細(xì)胞核）的死細(xì)胞。

E,、活力 =（綠色細(xì)胞/單位面積）/（單位面積上鋪板的總細(xì)胞數(shù)） 或者存活率 = 綠色細(xì)胞/（綠色細(xì)胞 + 紅色細(xì)胞）