蛋白質(zhì)合成抑制劑,。抑制細(xì)菌、藻類原生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長,。

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌，各種動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞,。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌,。作用機(jī)制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中,。嘌呤霉素同A位點(diǎn)結(jié)合后,，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽,。

嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAC）,，賦予機(jī)體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,。

嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān),，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下,，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株,。

溶解性：溶于水,，參考濃度50mg/ml。

使用方法

1.建議使用濃度

哺乳動(dòng)物細(xì)胞：1-10 μg/mL,，最佳濃度需要?dú)缜€來確定,；

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL,。注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié),，而且受宿主細(xì)胞本身的影響。

2.溶解方法

用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液,，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存,；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的儲存液,。

3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型,、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度,、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān),。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要,。建議初次做實(shí)驗(yàn)的客戶一定要建立適合自身實(shí)驗(yàn)體系的殺死曲線（kill curve）,。

1） Day 1：24孔板內(nèi)以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn),。37℃細(xì)胞孵育過夜,；

2） Day 2：a）準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15μg/mL，至少5個(gè)梯度）,；b）往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基,；之后37℃孵育細(xì)胞；

3） Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,，并觀察細(xì)胞存活率,。

4） 根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,；

5） 每日監(jiān)測細(xì)胞,，觀察存活細(xì)胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物低濃度,。

4. 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后,，細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子,。

1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

注意：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí),，抗生素作用明顯,。細(xì)胞過于密集,，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降。最好進(jìn)行細(xì)胞分盤使其密度不超過25%,。

2）每隔2-3天,，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3）篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶,。病灶可能需要額外的一周或者更多時(shí)間,，這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。注意：每日進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察,。嘌呤霉素的篩選至少需要48h,，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

4）轉(zhuǎn)移和放置5-10個(gè)抗性克隆到一個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中,，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備,。

注意事項(xiàng)

1）為了您的安全和健康,，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2）嘌呤霉素為有毒化合物,，操作時(shí)請小心拿放,。