人胰島細(xì)胞

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細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1) 培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1. 準(zhǔn)備 McCOY's 5A 培養(yǎng)基(McCOY's 5A，SIGMA,貨號(hào) M4892,，添加 NaHC03 2.2g/L),，90%;you質(zhì)胎牛血清,，10%,。

2. 培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%;碳,，5%,。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3. 凍存液：90%培養(yǎng)基,，10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存,。

2) 細(xì)胞處理：

復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 lmL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37°C 水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ) 加 l-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 l〇cm皿中,，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過(guò)夜）。隔天換液并檢查細(xì)胞密度,。

細(xì)胞凍存：

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。消化方法按照細(xì)胞傳代方法步驟進(jìn)行， 重懸液使用血清,。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心,，用血清重懸浮，加 DMSO 至最終濃度為10%。加入 DMSO 后迅速混勻,，按每 lml 的數(shù)量分配到凍存管中,。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于 1X106個(gè)細(xì)胞凍存。

細(xì)胞接受后的處理：

1. 收到細(xì)胞后,，請(qǐng)檢查是否漏液,，如果漏液，請(qǐng)拍照片發(fā)給我們,。

2. 請(qǐng)先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),，去掉封口膜并將 T25瓶置于 37°C 培養(yǎng)約 2-3h〇

3. 棄去 T25瓶中的培養(yǎng)基，添加 6ml 本公司附帶的培養(yǎng)基,。

4. 如果細(xì)胞長(zhǎng)滿（90%以上）請(qǐng)及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,，傳代培養(yǎng)用 6ml 本公司附帶的培養(yǎng)基。

5. 接到細(xì)胞次日,，請(qǐng)檢查細(xì)胞是否污染,，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請(qǐng)及時(shí)與我們?nèi)〉寐?lián)系,。

人胰島細(xì)胞

培養(yǎng)方法：

收到細(xì)胞后,，在倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：

如果細(xì)胞未長(zhǎng)滿，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺(tái)內(nèi),，嚴(yán)格無(wú)菌操作,，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，留10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

如果細(xì)胞已長(zhǎng)滿（達(dá)80-90%）,。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下：

a,，棄去培養(yǎng)液,，用PBS洗1-2次。

b,，向瓶?jī)?nèi)加入1.0-2.0ml酶液,，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓,，迅速拿回操作臺(tái),，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培養(yǎng)液,，輕輕吹打細(xì)胞,。

c，加入等量的的培養(yǎng)液,，輕輕吹打混勻后吸出一半,，分到新的培養(yǎng)

d,，傳代比例：1:2-1:3

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞,，1000RPM,，常溫條件下離心 5分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加 l-2mL 培養(yǎng)液后吹句,，將細(xì)胞懸液按 1: 2到 1: 5的比例分到新的含 8ml 培 養(yǎng)基的 新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式,，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì) 胞懸 液按 1: 2到 1: 3的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱,；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基,。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出,，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水,，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）,。輕輕晃動(dòng)凍存管,，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)易受損的溫度段（-5~0℃）,。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中,，避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi),，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi),，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散,，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡,。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),。

4）800rpm離心5min,，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基,，吹打制成細(xì)胞懸液,。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基,，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻,，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng),。

6）隔天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞,。繼續(xù)培養(yǎng),，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代,，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),。

友情提示注意以下幾點(diǎn)：

1、收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快更換為含15%血清的新鮮培養(yǎng)基,，如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶,，請(qǐng)?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清

2、貼壁細(xì)胞收到當(dāng)天切忌立刻消化,，請(qǐng)將細(xì)胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到隔天再做消化傳代,，請(qǐng)優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代培養(yǎng)

3、如簽收時(shí)出現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁破裂,，漏液等情況請(qǐng)及時(shí)做好照片記錄并聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室

細(xì)胞用途：僅供科研使用,。