All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase)

貨號(hào)：F0202

儲(chǔ)存條件：-20℃

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix是一款高效,、便捷、減少污染的高質(zhì)量一鏈cDNA合成試劑盒,，包含M-MLV GIII Reverse Transcriptase及其反應(yīng)Buffer,、RNA酶抑制劑、dNTPs, Oligo(dT)₂₀VN和隨機(jī)引物等一鏈cDNA合成所需的所有組分,，僅需加入RNA模板和水即可開(kāi)始反應(yīng),。使用該逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得的cDNA，下游可用于qPCR,、普通PCR等實(shí)驗(yàn),。

本試劑盒采用dsDNase高效去除基因組DNA污染，區(qū)別于常規(guī)的DNase l, dsDNase 能夠特異性的消化雙鏈DNA (dsDNA以及DNA與RNA的雜合鏈),，并且具有熱敏感性,，可在高溫條件下快速不可逆地失活。與傳統(tǒng)使用DNase l去除基因組DNA污染的方法相比,，dsDNase無(wú)需額外加入EDTA進(jìn)行失活,，不僅節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且降低了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的抑制,。All-in-OneFirst-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase)作為升級(jí)后的一鏈cDNA合成試劑盒,，15分鐘內(nèi)最長(zhǎng)可獲得12 kb cDNA。

可依據(jù)基因組污染嚴(yán)重程度選擇采用去基因組DNA污染與反轉(zhuǎn)錄分開(kāi)進(jìn)行的操作方法,，或者去基因組污染與反轉(zhuǎn)錄一步法進(jìn)行的操作方法,。

使用方法：

針對(duì)基因組含量低的RNA樣品(推薦方案)

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 推薦采用試劑盒提取的 RNA 作為模板

② 輕柔吸打混勻，瞬離,；

③ 37℃溫育2min,，以去除基因組DNA污染,；

④ 55℃溫育15 min;

⑤ 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育5 min以終止反應(yīng);注：若RNA中基因組DNA污染嚴(yán)重,，可適當(dāng)延長(zhǎng)37℃溫育時(shí)間至5 min,。

⑥ 迅速將獲得的 cDNA置于冰上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);或立即保存于-20°C,。

針對(duì)基因組含量高 RNA 樣品

1. 基因組 DNA 污染去除

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 推薦采用試劑盒提取的RNA作為模板,。

② 輕柔吸打混勻，瞬離;

③ 37°℃溫育2 min,，以去除基因組DNA污染;

注:若RNA中基因組DNA污染嚴(yán)重,，可適當(dāng)延長(zhǎng)37℃溫育時(shí)間至5 min。

④ 65℃溫育2 min,，使dsDNase失活,，冰上放置。

2. First-Strand cDNA合成

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 輕柔吸打混勻,，瞬離,；

③ 50℃溫育15min；

注：若目標(biāo)RNA不含Poly(A)結(jié)構(gòu),，可預(yù)先25℃溫育10min,。

④ 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育5min,，以終止反應(yīng),；

⑤ 將獲得的 cDNA 溶液置于冰上,，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。

注：cDNA溶液置于-20℃儲(chǔ)存，建議不超過(guò)1周,；置于-80℃可長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。

注意事項(xiàng)

預(yù)混液中已經(jīng)包含Oligo(dT)₂₀VN和隨機(jī)引物，不僅適用于包含Poly(A)結(jié)構(gòu)的真核生物mRNA,，也適用于不含Poly(A)結(jié)構(gòu)的原核生物RNA,、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小RNA模板,。