NCI-N87+luc人胃癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記

,NCI-N87 luc

貨號(hào)：YJ-0080a（STR（NCI-N87鑒定））

價(jià)格： 3200.0

規(guī)格： 1*10 ⁶

細(xì)胞介紹

NCI-N87細(xì)胞表達(dá)表面糖蛋白癌胚抗原(CEA)和TAG 72, 并且沒(méi)有左旋多巴胺脫羧酶(DDC)活性,。它們的血管活性的腸肽(VIP)受體活性極低并缺乏胃泌激素受體,。 它們表達(dá)蕈毒堿膽堿受體,。沒(méi)有證據(jù)表明存在N-myc, L-myc, myb和EGF受體基因的重組。這個(gè)細(xì)胞株表達(dá)的c-myc和c-erb-B 2 RNA水平與其它細(xì)胞株相當(dāng),。以下基因不表達(dá): N-myc, L-myc, c-cis, IGF-2, 或胃泌激素釋放肽,。據(jù)報(bào)道NCI-N87 細(xì)胞的植板率為4.3%。

該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因,。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：胃癌,，肝轉(zhuǎn)移

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1*10 ⁶細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用,。

細(xì)胞篩選

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Luc的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其Luc熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱,。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度,，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選。        

建議收到細(xì)胞后至少傳3代,，凍存留種后再進(jìn)行篩選,。

初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí)，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基維持培養(yǎng),，若無(wú)細(xì)胞漂浮或者漂浮較少,，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類(lèi)推,，至最高藥物濃度為5ug/ml,。若篩選過(guò)程中，漂浮細(xì)胞大于60%,，則停止篩選,，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%,，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選,。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖，可停止篩選,，用不含藥*培養(yǎng)基正常培養(yǎng),。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系,。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作,。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。

2）請(qǐng)?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀(guān)照片一張留存,，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況,，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上,，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中,，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收,。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 ,。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基               (YJ-0002)                       87 %

優(yōu)質(zhì)胎牛血清                                                                     10 %

P/S青霉素-鏈霉素                                                               1%

GlutaMAX-1谷氨酰胺               ( YJ-0900 )                       1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉           ( YJ-01100 )                  1%

注意事項(xiàng)：該細(xì)胞貼壁較慢，且生長(zhǎng)緩慢,，建議復(fù)蘇,、傳代后讓細(xì)胞貼壁48h后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。細(xì)胞最初將附著形成小島狀,，然后在這些密集的斑塊中增殖,，因此很難正確估計(jì)匯合度。避免細(xì)胞過(guò)密生長(zhǎng),，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,，以免培養(yǎng)基的pH受到不利影響。該細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),，在培養(yǎng)基中會(huì)有一些漂浮細(xì)胞和碎片,，并且在該細(xì)胞中可能會(huì)觀(guān)察到較大的“囊泡”和顆粒狀外觀(guān)，是正?，F(xiàn)象,。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳,，5%。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二．細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,。第二天顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間）,，然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。 

3.輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行,。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用,。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中,，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,，去掉上清,。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ,，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng),、代數(shù),、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,，-80度冰箱中過(guò)夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用,。

注意事項(xiàng)

1.收到細(xì)胞后,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2.收到細(xì)胞先不開(kāi)瓶蓋,，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。接著在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀(guān)拍一張照片,，觀(guān)察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*,，200*各一張）,，觀(guān)察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷(xiāo)售依據(jù),。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境,、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶(hù)收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài),，故客戶(hù)需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶(hù)提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明,，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

 NCI-N87+luc人胃癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記