超快熒光測試系統(tǒng)FLIM
- 公司名稱 北京卓立漢光儀器有限公司
- 品牌 ZOLIX/卓立漢光
- 型號
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時間 2024/5/20 21:26:20
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| 應用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,食品,電子 |
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熒光和熒光壽命
分子包含多個單能態(tài)S0,、S1、S2…和三重態(tài)T1…,，每個能態(tài)都包含多個精細的能級,。正常情況下，大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級上,，當分子被光束照射,，會吸收光子能量，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上,，在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時間,，便會通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程躍遷到S1 上，而S1 能態(tài)上的電子亦會在極短時間內(nèi)躍遷到S1 的*低能級上,，而這些電子會存在一段時間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài),，這個過程會釋放一個光子，即熒光,。
此外,，亦會有電子躍遷至三重態(tài)T1 上，再由T1 躍遷至基態(tài),，我們稱之為磷光,。
熒光特性
研究熒光特性時，主要在以下幾方面進行分析：激發(fā)光譜,，發(fā)射光譜,、熒光強度、偏振熒光,、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率,、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時間（納秒量級）,。
熒光壽命測試
熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時域測量和頻域測量時間穩(wěn)定性實驗測試曲線：
1 時域測量
由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1,，接著測量熒光的發(fā)射幾率隨時間的變化,。其中目前廣泛應用的是時間相關(guān)單光子計數(shù)，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC) 實現(xiàn)了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測試,，此方法對數(shù)據(jù)的獲取*依賴快速探測器和高速電路,。用統(tǒng)計的方法計算樣品受激后發(fā)出的第一個( 也是*一的一個) 光子與激發(fā)光之間的時間差，也就是下圖的START( 激發(fā)時刻) 與STOP( 發(fā)光時刻) 的時間差,。由于對于Stop 信號的要求,，所以TCSPC 一般需要高重復頻率的光源作為激發(fā)源，其重復至少要在100KHz 以上,，多數(shù)的光源都會達到MHz 量級,；同時，在一般情況下還要對Stop 信號做數(shù)量上的控制，做到盡量滿足在一個激發(fā)周期內(nèi),，樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個光子的有效熒光信號,，避免光子對的出現(xiàn)。
2 頻域測量
對連續(xù)激發(fā)光進行振幅調(diào)制后,，分子發(fā)出的熒光強度也會受到振幅調(diào)制,，兩個調(diào)制信號之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差，因此可以測量該相位差計算熒光壽命,。
左圖為正弦調(diào)制激發(fā)光（綠色）頻域顯示,，發(fā)射光信號（紅色）相應的相位變化頻域顯示。
右圖為對應不同壽命的調(diào)制和相位的頻域顯示,。TM- 調(diào)制壽命,，TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術(shù)（FLIM）
顯微熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy,，F(xiàn)LIM）是一種在顯微尺度下展現(xiàn)熒光壽命空間分布的技術(shù),，由于其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術(shù)無法代替的優(yōu)異性能,，目前在生物醫(yī)學工程,、光電半導體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測量手段。
FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光掃描FLIM,。
寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號,，再由一寬場相機采集熒光成像。寬場FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像,。時域或是頻域壽命采集都可以應用在寬場成像FLIM 上,。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針對選定區(qū)域內(nèi)的樣品逐點獲取其熒光衰減曲線,，再經(jīng)過擬合最終合成熒光壽命圖像,。相比寬場FLIM，其在空間分辨率,、信噪比方面有更大的優(yōu)勢,。掃描方式有兩種：一種是固定樣品，移動激光進行掃描,，一種是固定激光,，電動位移臺帶動樣品移動進行掃描。
超快熒光測試系統(tǒng)FLIM應用
材料科學領(lǐng)域寬禁帶半導體如GaN,、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量
量子點如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析,、缺陷檢測
銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽能電池的組分,、缺陷檢測
鑭系上轉(zhuǎn)換納米顆粒
GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴散研究
生命科學領(lǐng)域
細胞體自身熒光壽命分析
自身熒光相對熒光標記的有效區(qū)分
活細胞內(nèi)水介質(zhì)的PH 值測量
局部氧氣濃度測量
具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標記的區(qū)分
活細胞內(nèi)鈣濃度測量
時間分辨共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級尺度上的遠差測量,，環(huán)境敏感的FRET 探針定量測量
代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像
超快熒光測試系統(tǒng)FLIM應用案例
1 用熒光分子對海拉細胞進行染色
用熒光分子轉(zhuǎn)子Bodipy-C12 對海拉細胞（宮頸癌細胞的一種） 進行染色,。
(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命范圍1ns（藍色）到2.5ns（紅色）,；
(b) 熒光壽命直方圖,，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細胞中其他位置壽命較長,，在1.8ns 附近,。
用熒光分子轉(zhuǎn)子的時間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標簽特性，且與熒光團的濃度無關(guān),。[2]
2 金屬修飾熒光
金屬修飾熒光：
(a) 熒光壽命是熒光團到金表面距離的函數(shù),；
(b) 用綠色熒光蛋白（GFP）標記乳腺腺癌細胞的細胞膜的共聚焦xz 橫截面，垂直比例尺：5m,；
(c) b 圖的FLIM 圖,，金表面附近的GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽能電池
下圖研究中,，展示了一種動態(tài)熱風（DHA）制備工藝來控制全無機PSC 的薄膜形態(tài)和穩(wěn)定性,，該工藝不含有常規(guī)的有害反溶劑，可以在大氣環(huán)境中制備,。同時,，鈣鈦礦摻有鋇（Ba2+） 堿金屬離子（BaI2:CsPbI2Br）。這種DHA 方法有助于形成均勻的晶粒并控制結(jié)晶,，從而形成穩(wěn)定的全無機PSC,。從而在環(huán)境條件下形成完整的黑色相。經(jīng)過DHA處理的鈣鈦礦光伏器件,，在0.09cm小面積下,，效率為14.85%，在1x1cm的大面積下,，具有13.78%的*高效率,。DHA方法制備的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍寶石和(b) GaN 上生長的MQWs 的共焦PL mapping 圖像,。具有較小尺寸的發(fā)光團的最高密度是觀察到在GaN 上生長的MQWs,。在(c) 藍寶石和(d)GaN 上生長的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對于在GaN 上生長的MQWs,，強的PL 強度區(qū)域與較長PL 衰減時間的區(qū)域很好地匹配。在(e) 藍寶石和(f)GaN 上生長的MQWs 在A 點和B 點測量的局部PL 衰減曲線,，均標記在圖中,。對于在GaN 上生長的MQWs，點A 和B 之間的PL 衰減時間差更高,。
參數(shù)配置
北京卓立漢光儀器有限公司提供的顯微熒光壽命成像系統(tǒng)是基于顯微和時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù),，配合高精度位移臺得到微觀樣品表面各空間分布點的熒光衰減曲線,，再經(jīng)過用數(shù)據(jù)擬合，得到樣品表面發(fā)光壽命表征的影像,。是光電半導體材料,、熒光標記常用熒光分子等類似熒光壽命大多分布在納秒、幾十,、幾百納秒尺度的物質(zhì)的選擇,。
參數(shù)指標：
系統(tǒng)性能指標 | |
光譜掃描范圍 | 200-900nm |
最小時間分辨率 | 16ps |
熒光壽命測量范圍 | 500ps-1μs@ 皮秒脈沖激光器 |
空間分辨率 | ≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈沖激光器 |
熒光壽命檢測IRF | ≤2ns |
配置參數(shù) | |
激發(fā)源及匹配光譜范圍 （光源參數(shù)基于 50MHz 重復頻率） | 375nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：30ps,，平均功率1.5mW,，熒光波段：400-850nm |
405nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：25ps,，平均功率2.5mW,，熒光波段：430-920nm | |
450nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：50ps,，平均功率1.9mW,，熒光波段：485-950nm | |
488nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：70ps,，平均功率1.3mW,，熒光波段：500-950nm | |
510nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：75ps,，平均功率1.1mW,，熒光波段：535-950nm | |
635nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：65ps,，平均功率4.3mW,，熒光波段：670-950nm | |
660nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：60ps,，平均功率1.9mW,，熒光波段：690-950nm | |
670nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：40ps,，平均功率0.8mW,，熒光波段：700-950nm | |
科研級正置顯微鏡 | 落射明暗場鹵素燈照明，12V,，100W 5 孔物鏡轉(zhuǎn)盤,，標配明場用物鏡：10×，50×,，100× 監(jiān)視CCD：高清彩色CMOS 攝像頭,，像元尺寸：3.6μm*3.6μm， 有效像素：1280H*1024V,，掃描方式：逐行,，快門方式：電子快門 |
電動位移臺 | 高精度電動XY 樣品臺,，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， 最小步進：50nm,，重復定位精度：＜ 1μm |
光譜儀 | 320mm 焦距影像校正單色儀,，雙入口、狹縫出口,、CCD 出口,， 配置三塊68×68mm 大面積光柵，波長準確度：±0.1nm,， 波長重復性：±0.01nm,，掃描步距：0.0025nm，焦面尺寸：30mm(w)×14mm(h),， 狹縫縫寬：0.01-3mm 連續(xù)電動可調(diào) |
探測器：制冷型紫外可見光電倍增管,，光譜范圍：185-900nm（標配，可擴展） | |
光譜CCD （可擴展PLmapping） | 低噪音科學級光譜CCD（LDC-DD）,，芯片格式：2000x256,， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測面：30mm*3.8mm，背照式深耗盡芯片,， 低暗電流,，*低制冷溫度-60℃ @25℃環(huán)境溫度，風冷,，最高量子效率值>95% |
時間相關(guān)單光子計數(shù)器（TCSPC） | 時間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs,，死時間＜ 10ns， *高65535 個直方圖時間窗口,，瞬時飽和計數(shù)率：100Mcps,，支持穩(wěn)態(tài)光譜測試； |
OmniFluo-FM 熒光壽命成像專用軟件 | 控制功能：控制樣品平移臺移動,，通過顯微鏡的明場光學像定位到合適區(qū)域,， 框選掃描區(qū)域進行掃描，逐點獲得熒光衰減曲線,，實時生成熒光圖像等 數(shù)據(jù)處理功能：自動對掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù),，逐點進行多組分熒光壽命擬合 （組分數(shù)小于等于4），對逐點擬合獲得的熒光強度,、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能：直方圖,、色表、等高線,、截線分析,、3D 顯示等 |
操作電腦 | 品牌操作電腦，Windows 10 操作系統(tǒng) |
軟件界面
控制測試界面
測試軟件的界面遵循“All In One”的簡潔設計思路，用戶可在下圖所示的控制界面中完成采集數(shù)據(jù)的所有步驟：包括控制樣品平移臺移動,，通過顯微鏡的明場光學像定位到合適區(qū)域，框選掃描區(qū)域進行掃描,，逐點獲得熒光衰減曲線,，實時生成熒光圖像等。
數(shù)據(jù)處理界面
功能豐富的熒光壽命數(shù)據(jù)處理軟件,，充分挖掘用戶數(shù)據(jù)中的寶貴信息,。可自動對掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù),，逐點進行多組分熒光壽命擬合（組分數(shù)小于等于4）,，對逐點擬合獲得的熒光強度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示,。
自主開發(fā)的一套時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC）熒光壽命的擬合算法,，可對熒光衰減曲線中最多包含4 個時間組分的熒光過程進行擬合，獲得每個組分的熒光壽命,，光子數(shù)比例,，計算評價函數(shù)和殘差。TCSPC 熒光壽命通常并非簡單的指數(shù)衰減過程,，而是與光源及探測器相關(guān)的儀器響應函數(shù)（IRF）與熒光衰減過程相互卷積的結(jié)果,，因此適當?shù)臄M合方法和參數(shù)選擇對獲得正確可靠的熒光壽命非常重要。該軟件可導入實際測量的IRF 對衰減曲線進行卷積計算和擬合,。但是大多數(shù)情況下,， IRF 很難正確的從實驗獲得，針對這種情況,，軟件提供了兩種無需實驗獲取IRF 的擬合方法：
1.通過算法對數(shù)據(jù)上升沿進行擬合,，獲得時間響應函數(shù)IRF，然后對整條衰減曲線進行卷積計算和擬合得到熒光壽命,。
2.對于衰減時間遠長于儀器響應時間的,，可對衰減曲線下降沿進行直接的指數(shù)擬合。該軟件經(jīng)過大量測試,，可以很好的滿足各種場合的用戶需求,。
MicroLED 微盤的熒光強度像（3D 顯示）：
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