穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

貨號：C10000

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建

外源基因在細胞中的表達可分為兩大類,，一類是瞬時表達,，一類是穩(wěn)定表達。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,，雖然可以達到高水平的表達,，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上,，使宿主細胞可*表達目的基因,。建立穩(wěn)定細胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物對靶細胞進行篩選,?？剐詷?biāo)記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin）,，Hygromycin B,、G418和puromycin進行選擇性篩選。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉(zhuǎn)染后對靶細胞進行篩選,， 終獲得從單一細胞擴增起來的穩(wěn)定細胞株， 該方法陽性率低,，周期長,，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒,，攜帶的外源基因在病毒感染細胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA,，再整合到宿主細胞基因組以后才能表達,。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可以在短時間內(nèi)獲得高效率的穩(wěn)定細胞株,。篩選得到的細胞或者可穩(wěn)定表達目的蛋白,，用于蛋白的擴增和富集；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細胞株

1.需客戶告知目的基因具體信息,，確定穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的類型

2.提供相關(guān)的實驗圖片,、實驗數(shù)據(jù)、構(gòu)建完成的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

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穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

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是一種經(jīng)過特定基因修飾的細胞株,，可根據(jù)實驗所需表達外源基因,、進行基因敲除、敲入,、以及精確改變基因序列（如點突變）,。對比一般瞬轉(zhuǎn)方法，利用細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株開展實驗?zāi)軌颢@得長期而穩(wěn)定的特定性狀,，因此有助于增強實驗的可重復(fù)性,。細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株除了可用于基因調(diào)控研究，也非常適合于長周期的藥物篩選和藥理學(xué)研究,、重組蛋白和抗通過慢病毒系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將外源基因表達框穩(wěn)定整合進靶細胞基因組,，實現(xiàn)外源基因在靶細胞的長期穩(wěn)定表達。對比瞬轉(zhuǎn)方法,，構(gòu)建過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株可避免瞬轉(zhuǎn)中因轉(zhuǎn)染效率導(dǎo)致的表達效率不一致的問題,。構(gòu)建好的細胞株中的外源基因不會因為細胞傳代而丟失，可以持續(xù)表達特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究,，重復(fù)實驗時不需要對細胞重新轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,，大為節(jié)省了實驗時間。體生產(chǎn)等實驗,。載體家憑借其資源完備的載體定制平臺,，通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)常規(guī)腫瘤細胞的方式可構(gòu)建多種應(yīng)用類型的細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

　　構(gòu)建CRISPR基因編輯細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株是當(dāng)今研究基因和細胞功能關(guān)系的流行工具,。通過gRNA引導(dǎo)Cas9靶向靶細胞基因組特定序列的CRISPR基因編輯,，如基因敲除、敲入和定點突變,，可以從DNA水平修飾靶細胞的基因序列,。載體家提供兩種gRNA表達模式，第一種是轉(zhuǎn)導(dǎo)gRNA/Cas9共表達載體,，gRNA和Cas9在細胞株中同時表達,。第二種是構(gòu)建Cas9表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株，再根據(jù)實驗需求導(dǎo)入gRNA表達載體。使用單Cas9表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以獲得更大的實驗靈活性,，如導(dǎo)入多個gRNA打靶GOI,，或者多個gRNA與多種Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之間進行搭配等。

　　CRISPR基因編輯系統(tǒng)可選擇單gRNA或雙gRNA表達方式,。雙gRNA表達載體常用于以下需要兩個gRNA同時打靶的場景：1）雙gRNA引導(dǎo)兩個Cas9 nickase分別打靶靶位點的正反義DNA鏈,，形成DSB并獲得比單gRNA更特異的打靶效果；2）通過在形成兩個DSB,，實現(xiàn)目標(biāo)序列的大片段刪除,；3）同時打靶兩個不同的基因。雙gRNA表達載體由兩個U6啟動子驅(qū)動gRNA的表達,。

　　載體家CRISPR基因編輯載體可采用多類方式進行轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞,。除基因敲入和定點突變常用的gRNA瞬轉(zhuǎn)Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株的方法外，我們還提供慢病毒,、腺病毒,、腺相關(guān)病毒、PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體等多種外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式,，以滿足體外或體內(nèi)多樣CRISPR基因編輯實驗需求,。

　　采用Tet-on系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達目的基因，雖然可以直接進行質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn),，但是載體家亦提供該類載體的慢病毒包裝以構(gòu)建相關(guān)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,。構(gòu)建好的Tet-On系統(tǒng)細胞株同時表達tTS和rtTA兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,而目的基因的表達可受四環(huán)素調(diào)控。其中tTS在四環(huán)素不存在的情況下會結(jié)合目的基因的上游TRE啟動子,，抑制目的基因表達,。在細胞體系中添加四環(huán)素或其類似物后，rtTA進行響應(yīng)并結(jié)合TRE啟動子,，激活目的基因表達,。

　　shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株一般使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒在靶細胞基因組中導(dǎo)入shRNA表達框，實現(xiàn)shRNA在細胞系中的長期穩(wěn)定表達,。不同于siRNA瞬轉(zhuǎn),，shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株可內(nèi)源性地穩(wěn)定表達siRNA效果，不受轉(zhuǎn)染效率影響,，從而獲得更穩(wěn)定的基因敲低效果,。