GV3101 感受態(tài)細(xì)胞基因型

C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R) Nopaline

GV3101 感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明

GV3101菌株為C58型背景,，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移),。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent,，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥,、煙草,、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作,，本公司生產(chǎn)的GV3101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,，pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化,，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中,。

2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量）,，用手管底混勻,，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘,、37℃水浴5分鐘,、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基,，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時,。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時,，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan,，20 μg/ml rif 時,，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）,。

GV3101 感受態(tài)細(xì)胞注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10,；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降,；質(zhì)粒增大一倍,，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作,。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時,，由于營養(yǎng)不足,，陽性克隆生長變慢，菌落變小,，為了獲得大的菌落,，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan,，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2,。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌,；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失,，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素,，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略),。

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗,；S：敏感,。）

3,、LB及YEB配方：

10種農(nóng)桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)產(chǎn)品僅需冰,、液氮和37℃ 熱激操作即可，實驗簡單方便,，經(jīng)pCAMBIA2301 (11.6 Kb)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×10⁴ cfu/μg,。同時提供7種農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)產(chǎn)品，可成功轉(zhuǎn)化大于50 Kb的載體，經(jīng)pCAMBIA2301 (11.6 Kb)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×10⁵ cfu/μg,。