兩步質粒DNA純化分離rRNA~加速神器 CIM DEAE整體柱

兩步質粒DNA純化分離rRNA~加速神器 CIM DEAE整體柱

  面對如此眾多品種的質粒，有沒有一種質粒 DNA 純化平臺,，能夠適用多種質粒的,、可放大的,，滿足基因治療、細胞治療和疫苗的高純度和同質性的標準要求,，并且還需要有效,，穩(wěn)健和可擴展的下游過程呢?

   接下來為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對流相互作用介質（CIM）層析整體柱的兩步質粒 DNA（pDNA）純化平臺,！
   該方法除了具有以上全部優(yōu)點,，并且可以明顯降低純化時間，提高生產(chǎn)效率,，使其成為 GMP 環(huán)境下的大規(guī)模 pDNA 純化的選擇,。
   該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設計，可實現(xiàn)快速操作,，高流量,，同時提供動態(tài)結合能力和分辨率。

首先要為整個過程中的核心——兩步層析步驟,，準備細菌培養(yǎng)液
 

1. 大腸桿菌收獲,、裂解－堿裂解：
 

這是快速高效純化質粒 DNA 亞型的基礎。
 

操作建議：
 

  先收集菌體,；
  然后采用堿性裂解法制備原料,；

  再將細菌細胞（通常是細胞生物質或細胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA,，pH8.0 中,；

  通過加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進行裂解,。

2. 裂解液濃縮：
 

氯化鈣沉淀后澄清,，除去了大量的主要樣品雜質

???????   裂解后，懸浮液變粘稠,，通過加入與懸浮緩沖液等體積的,，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細胞碎片和 SDS 復合物。

???????   在溫和混合下,，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘,。

TIPS:
 

1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA,、基因組 DNA 和其他雜質;

2. 較高濃度的雜質需要 CaCl2 濃度高達 1M;

3. 考慮測試多種濃度并評估產(chǎn)品中雜質的有效去除和未受影響的 pDNA 產(chǎn)量;

4. 加入速度應該很慢,，以防止局部溫度上升;

5. 孵育后，進行一系列澄清步驟,，從離心或粗過濾開始,，例如 80μm 深度過濾，并以 1-5μm 過濾結束。

（低溫有利于沉淀,，混合過程應該溫和操作,，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 說了那么多,，然而純化才是本工藝的精華所在,。
 

BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性,、時效性,，均堪稱教科書式的經(jīng)典。
 

一步純化的柱子,，通過弱陰離子交換,，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA,；
 

第二步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟,，進一步從超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
 

兩步純化的作用功能明確,、互相合作,，大大節(jié)省操作步驟和時間。

???????   AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA,，并去除大部分 HCP,、mRNA 和基因組 DNA。

???????   在弱陰離子交換柱上捕獲質粒 DNA,，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質,，樣品結合需要低電導率，通過稀釋實現(xiàn),。 

???????   隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA,，然后洗脫質粒 DNA,。

層析條件
 

*1 選擇色譜柱體積,，取決于需要處理的樣品量,。
 

層析方法
 

1.  用去離子水稀釋細菌裂解物至電導率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度,。

2.  將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進行過濾,。

3.  將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  將澄清的稀釋細菌裂解液進行上樣,。

5.  用 20 CV 的緩沖液 A1 對色譜柱進行流洗,。

6.  用 20 CV 的緩沖液 A2 對色譜柱進行流洗。

7.  用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質粒 DNA 洗脫曲線

???????    在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上,，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟,，進一步從        超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。

??????? ???????   為了富集質粒 DNA 的超螺旋亞型,，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上,。 

??????? ???????   該步驟進一步去除了雜質。

層析條件

*2 選擇色譜柱體積,，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法

1.  調(diào)節(jié)來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液,，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4,。

2.  用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3.  將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣,。

4.  用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱,。

5.  用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱,。

7.  加樣 3 次后,，對柱子進行清洗。

圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質粒 DNA

·  從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋 pDNA 組份含有硫酸銨,，必須在生物應用質粒之前將其除去,。

·  緩沖液交換可通過透析濾過或體積排除色譜等方法進行。

·  配置和填充可能需要額外的處理,。
 

二步法層析過程分析：

???????    質粒 DNA 制造成功的關鍵是實時過程控制方法,，確保終產(chǎn)品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

??????????   CIMac™pDNA 分析柱可用于監(jiān)測降解產(chǎn)物（開環(huán)和線性 pDNA）,，去除雜質（RNA）,，并確保每個生產(chǎn)步驟都能產(chǎn)生預期的超螺旋 pDNA 量。

???????   ???????CIMac™pDNA 分析柱還用于超螺旋質粒 DNA 含量的質量控制,。

圖 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的質粒 DNA 亞型含量的質量控制

結果和結論：
 

??????? ?????  通過優(yōu)化裂解,、沉淀和兩種色譜步驟相結合，可生產(chǎn)滿足所有監(jiān)管要求的純 pDNA,。

??????? ???????  可以完成去除 99% 以上的主要雜質（RNA,，基因組 DNA，宿主細胞蛋白,，內(nèi)毒素和開環(huán) pDNA）,。

??????? ???????  此外，快速（大腸桿菌的 pDNA 提取和純化可在幾小時內(nèi)完成）,，可重復的過程可降低運營成本并提高工廠生產(chǎn)率,。 

??????? ???????  *的整體特性有助于該過程的直接可擴展性,，涵蓋從小規(guī)模實驗室到大規(guī)模工業(yè)純化 pDNA 的生產(chǎn)水平。

Table 1: Process results.

點評 
 

目前市面上有不少質粒純化工藝方案,，但是比較下來,，BIA 二步法純化工藝具有兩大優(yōu)勢：
 

???????  效率明顯提高

只需兩步色譜和高流速的整體柱色譜方案，減少工藝步驟（提高回收率）并加快純化速度,，從而顯著提高生產(chǎn)率,。
 

???????   靈活放大

由于特定的整體柱設計，質粒 DNA 過程可以快速擴展到更大的單位,。 

在 1 毫升色譜柱上設計的工藝可以輕松轉移到試驗和生產(chǎn)規(guī)模,。

在 8L 色譜柱上單次運行可以產(chǎn)生 48 g 藥物級 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

十多年來,，BIA Separations 一直是高效率質粒純化的好選擇,。它不僅提供整體柱和平臺模板，還提供定制的純化服務,，以*您的質粒 DNA 純化需求,。