單克隆抗體(MAb)是針專- -的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體,，單克隆技術(shù)又名雜交瘤技術(shù)起源于1975年,，由G. KOhler和Milstein創(chuàng)立。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞雜交融合成雜交瘤細(xì)胞,，生產(chǎn)抗體,。

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗是針對(duì)體的主要步驟包括:

(1 )抗原制備，

(2)免疫動(dòng)物,

(3)免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備,

(4)細(xì)胞融合;

(5)雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng),，

(6)雜交瘤細(xì)胞的篩選;

(7)雜交瘤細(xì)胞的克隆化;

(8)單克隆抗體的檢定;

(9)分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立:

(10)單克隆抗體的大量制備,。

單克隆抗體的制備過(guò)程:

1、免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠,，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的過(guò)程,。一般選用6- 8周齡雌性Balb/c小鼠,，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射,。抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官,，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆,，使其活化、增殖,，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞,。

2、細(xì)胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠,，無(wú)菌操作取出脾臟,，在平皿內(nèi)擠壓研磨,，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合, 并加入促融合劑聚乙二醇,。在聚乙二醇作下,，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞,。

3,、選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基,。 在HAT培養(yǎng)基中,，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡,。未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡,。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖,。

4,、雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞,，因此,，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),。采用靈敏,、快速、特異的免疫學(xué)方法,，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。

經(jīng)過(guò)全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型,、亞類,、特異性、親和力,、識(shí)別抗原的表位及其分子后,，及時(shí)進(jìn)行凍存。

5,、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體

外培養(yǎng)法,。

(1)體內(nèi)誘生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0. 5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理,。1-2周后,，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞,。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體,。約1-2周,，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,，即可獲得大量單克隆抗體,。

(2)體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中,，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體,，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片,，即可獲得所需要的單克隆抗體,。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來(lái),各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn),，大大提高了抗體的生產(chǎn)量,。雜交瘤細(xì)胞融合后，要進(jìn)行篩選后才能使用,。雜交瘤細(xì)胞分為兩次:一,、篩選出雜交瘤細(xì)胞;二、 在初選的雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞,，這兩次篩選的方法和原理各不相同,。

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