iElisa 玉米赤霉烯酮檢測試劑盒

iElisa 玉米赤霉烯酮檢測試劑盒

1. 概要 iElisa 玉米赤霉烯酮檢測試劑盒利用競爭性酶 聯(lián)免疫反應原理,，對玉米,、麥類、豆類,、大米等谷 物和飼料中玉米赤霉烯酮的含量進行定量檢測,。玉 米赤霉烯酮是由鐮刀菌類的真菌形成，它是一種植 物性激素,，并具雌激素性特征,。玉米赤霉烯酮具有 較強的生殖毒性和致畸作用，可引發(fā)動物發(fā)生雌性 激素亢進癥,，導致動物不孕或流產(chǎn),，對家畜特別是 豬,、牛和羊的影響較大。中國標準規(guī)定：玉米,、小 麥中玉米赤霉烯酮不得超過 60μg /kg,，配合飼料、 飼料原料玉米中玉米赤霉烯酮不得超過 500μg /kg,。 2. 原理 測定的基礎是抗原-抗體反應,。微孔板上包被有 抗抗體。加入玉米赤霉烯酮（ZEN）標準品或樣品,、 酶標抗原和抗體后,，游離的玉米赤霉烯酮與酶標抗 原競爭結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔 板上的抗抗體再結(jié)合,，沒有結(jié)合的標準品,、酶標抗 原及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯藍色,，加入終 止液后顏色由藍變黃,，用酶標儀在 450nm 處檢測， 吸光值與樣品中玉米赤霉烯酮含量成負相關,，與標 準曲線比較即可得出玉米赤霉烯酮的含量,。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條 ×8 孔） 2) 玉米赤酶烯酮標準品：0 ng/ml ,、0.5ng/ml,、 2.0ng/ml、5.0ng/ml,、15.0ng/ml,、50.0ng/ml； 1 瓶 × 1.0ml 3) ZEN酶標抗原： 1 瓶 ×10ml 4) ZEN抗體： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) ZEN稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) ZEN稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說明書： 1 份 11) 質(zhì)檢報告： 1 份 4. 需要的儀器,、試劑 1）儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當者） —微量移液器：20μl-200μl 單道,，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標板振蕩器 —渦旋混合器 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇,，加 300ml 純水,，混勻。 —純水（蒸餾水,、去離子水） 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥,、大麥,、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中,，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 15 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘,，或搖床上振蕩 40 分鐘）,，靜置 5 分鐘。 2） 將提取液用普通濾紙過濾,，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中,，加入 300μl ZEN 稀釋緩沖 液 A，用渦旋混合器混勻,。 稀釋倍數(shù)：20 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中,，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 15 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）,，靜置 5 分 鐘,。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，測 pH 值,，如果不 在 pH6-8 范圍內(nèi),，請用酸或堿進行調(diào)整。 3) 吸取 20μl 濾液置于 1.5ml 離心管中,，加入 380ul ZEN 稀釋緩沖液 B,，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：1005.3 尿液樣品： 1) 取 5ml 待檢樣品于 15ml 離心管中,，3000r/min,， 離心 10 分鐘 2) 吸取 100μl 離心后澄清樣品置于 1.5ml 離心管 中 3) 加入 400μl ZEN 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器 混勻,。 稀釋倍數(shù)：5 5.4 飼料（高靈敏度）： 4) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中,，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 15 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）,，靜置 5 分 鐘,。 5) 將提取液用普通濾紙過濾，測 pH 值,，如果不 在 pH6-8 范圍內(nèi),，請用酸或堿進行調(diào)整。 6) 吸取 50μl 濾液置于 1.5ml 離心管中,，加入 200ul ZEN 稀釋緩沖液 B,，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：25 5.5 植物油（花生油,、玉米油,、大豆油、芝麻油,、 橄欖油等）： 1) 稱取 5.0g 樣品于 50ml 離心管中,，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器 上振蕩 15 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分 鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）,，靜置 5 分鐘,。 2) 將提取液用普通濾紙過濾,，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl ZEN 稀釋緩沖 液 C,，用渦旋混合器混勻,。 稀釋倍數(shù)：20 5.6 塘渣樣品： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 15 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘,，或搖床上振蕩 40 分鐘）,，靜置 5 分 鐘。 2) 將提取液用普通濾紙過濾,，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中,，加入 300μl ZEN 稀釋緩沖 液 C，用渦旋混合器混勻,。 稀釋倍數(shù)：20 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）,。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于 洗板的*性,，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。 4) 所有溫育過程應避免陽光直射,，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板,。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根據(jù)實驗所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水,、去離子 水） 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用,。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標板架,，標準品和樣品做兩個平行實驗,，記錄 下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存,。 2) 吸取 50μl 標準品或樣品分別加至相應的微孔 （雙孔）中,，然后各加入 50μl 的 ZEN 酶標抗 原，再加入 50μl 的 ZEN 抗體,，加蓋,，在室溫 溫育 30 分鐘（每個標準品和樣品必須使用新 的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體,，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液,，置于酶標板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復操作四次,。洗完后用力在 吸水紙上拍干,。 4) 每孔加入150μl底物，室溫避光溫育10分鐘,。 5) 每孔加入50μl 終止液,。 6) 置于酶標儀中，振蕩混勻,，在450nm處測定吸 光度值（OD值）,，參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標儀可以直接讀出,、打印濃度值）,。 7. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值,。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以玉米赤霉烯酮標準品濃度值（ppb）為 X 軸,， 百分吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖,。相對應每 一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出,。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度,。利用計算機專 業(yè)軟件,，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應的稀釋倍 數(shù),。 3） 如果測定值超出檢測范圍,，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進行稀釋。 8. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導致數(shù)值偏低,。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況,， 則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn) 象,。所以洗板排干后應立即進行下一步操作,。 3) 標準物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下,。 4) 混合要均勻,，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強酸性物質(zhì),，避免接觸皮膚,。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒,，這樣會引起測定結(jié)果不 準確,。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍,。 9. 試劑盒的性能指標 1) 檢測限 LOD: 谷物 5ppb（μg /kg）,，飼料 50ppb(15ppb),尿液 3.0ppb，植物油 5ppb（μg /kg）,。（LOD：空白樣品測定值+2 倍標準偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 10ppb,，飼料 100ppb(20ppb), 尿液 5.0ppb,，植物油 20ppb。 3) 定 量 檢 測 范 圍 ： 谷 物 10-1000ppb ,， 飼 料 100-5000ppb（20-1200ppb）, 尿液 5-250ppb,， 植物油 20-1000ppb。