TIM-3 ELISA

TIM-3 ELISA——依托復旦大學,，集研發(fā),、銷售,、實驗室技術(shù)服務的產(chǎn)品涉及分子生物學、細胞生物學,、細菌學,、遺傳學、免疫學,、生物化學,、蛋白質(zhì)學、細胞治療,、臨床應用等領域,。

類別簡介:"專業(yè)經(jīng)營進口胎牛血清、細胞因子,、ELISA試劑盒,、細胞、抗體,、生物試劑,、耗材、培養(yǎng)基,、一抗,、二抗、其產(chǎn)品吸附均勻,，吸附性好,，空白值低，孔底透明度高,， 代做ELISA實驗等,。"

供應商 :乾思生物

貨期 :7-10天

◇      液體類標本:標本必須為液體，不含沉淀,。包括血清、血漿,、尿液,、胸腹水、腦脊液,、細胞培養(yǎng)上清,、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿,。每個標本量收集體積＝100ul×檢測種類,。

◇      血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。收集上清,。如有沉淀形成,，應再次離心。

◇      血漿：應根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA,、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，加入10％(v/v)抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細收集上清,。如有沉淀形成，應再次離心,。

◇      尿液,、胸腹水、腦脊液：用無菌管收集,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細收集上清。如有沉淀形成,，應再次離心,。

◇      細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。

1.  試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染,。

2.   加樣：加樣或加試劑時,，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時,，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的 “預孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作,，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。

4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數(shù),。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制,，不能混淆,。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10μl),，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘),，如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。

7.  底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射。建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性,。如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請后乘以稀釋倍數(shù)。

◇      注意事項：收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定,，對收集后當天進行檢測的標本,，儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集標本，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存,。避免反復凍融,，標本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月,，-70度可保存6個月,。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分： (1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑)； (2)酶標記的抗原或抗體(結(jié)合物),； (3)酶的底物,； (4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中)，參考標準品和控制血清(定量測定中),； (5)結(jié)合物及標本的稀釋液,； (6)洗滌液，在板式ELISA中,，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水,； (7)酶反應終止液，常用的HRP反應終止液為硫酸,，其濃度按加量及比色液終體積而異,，在板式ELISA中一般采用3mol/L。主要包括37000多種一抗,，1689種二抗,，61種標簽和標記物及42種試驗小包裝產(chǎn)品。

具體步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)液,，用PBS（不含鈣,，鎂離子）洗1-2次。
2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1-3分鐘預熱,，然后又將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30秒后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓分散,，輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，細胞隨即脫落下來,。
3. 加入6-8ml*培養(yǎng)基,，吸出，分到新的培養(yǎng)瓶中,。一傳二,。傳代后一半用我們的培養(yǎng)基，一半用你們的,，以免細胞不適應而造成生長不好,。

注：（1）各種試劑禁忌常年續(xù)加,；
（2）同一品牌不同批號的試劑不能混用；
（3）續(xù)加試劑后要重新定標,，標準液即開即用,；
（4）不同廠家的試劑禁用同一標準液定標；
（5）質(zhì)控必須用高,、中,、低值三個樣本每天隨患者標本測定；
(6) 抗凝劑的使用,；
(7) 校準液的正確使用,。如果細胞未長滿，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內(nèi),，嚴格無菌操作,，打開細胞培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)液,，僅留下10ml培養(yǎng)液在瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),。如果細胞已長滿，即可進行傳代培養(yǎng),。