關(guān)鍵詞：慧穎生物提供高品質(zhì)PC-3M2B4細胞株,，狀態(tài)良好,，傳代次數(shù)靠前，*,！

產(chǎn)品名稱：PC-3M2B4細胞

中文名稱：人前列腺癌低轉(zhuǎn)移細胞

規(guī)格：凍存管/25T培養(yǎng)瓶

貨期：10個工作日左右

質(zhì)量標準：無支原體,，無污染

上海慧穎生物提供4000多種類細胞株細胞系,，從源頭把控產(chǎn)品的可靠性,，復(fù)蘇，凍存,，傳代,，培養(yǎng)，嚴格無菌操作,，全國各地均可發(fā)貨,，遠到香港，澳門,，內(nèi)蒙古,，新疆石河子，寧夏,，海南等地,，全國訂購：！

原代細胞培養(yǎng)成功以后，需要進行分離培養(yǎng),，否則細胞會因生存空間不足或密度過大,，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長,。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株),，可以進行細胞克隆,，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征,。傳代PC-3M2B4細胞株形成細胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實驗材料,，便于實驗。1. 操作步驟（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,。（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量,。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化,，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察,，當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后,，應(yīng)立即中止消化,。（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量,，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液,。如果僅使用胰蛋白酶消化,，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,，終止消化,。（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細胞,，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔,，以防用力過猛損傷細胞,。（6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中,，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),。（7）細胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應(yīng)換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面,，即可使用,；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。2. 注意事項（1）掌握好細胞消化的時間,，消化時間過短時,，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導(dǎo)致細胞脫落,、損傷,。（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時,，消化時間應(yīng)縮短,，過低時細胞消化時間相對延長。三,、體內(nèi)細胞培養(yǎng)及其操作步驟1． 瘤細胞懸液接種（1）無菌選取生長良好(有光澤,，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞。   （2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨,，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細胞懸液,。（3）培養(yǎng)細胞應(yīng)用PBS洗兩遍。（4）計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至107～108／ml,。（5）常規(guī)消毒后,，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml／部位，＞106細胞),。初次接種成功率低,，細胞數(shù)盡可能多一些。（6）次日注意觀察動物一般情況,。初次接種一般有一段較長的潛伏期,，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，zui后固定為一個相對穩(wěn)定的時間,。2． 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔,、腹壁或其他部位，引起腹水,，腹水中含有瘤細胞,，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤,。初次傳代時,，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色,。腹水瘤的接種過程如下,。（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌,，進行細胞計數(shù)。（2）消毒動物,，左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞,。（3）接種腹水瘤細胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大,。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后,，用滴管吸取,。每只小鼠可抽3~5ml。（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min,，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆?。四,、培養(yǎng)細胞的凍存及復(fù)蘇細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細胞凍存在-196℃液氮中,，儲存時間幾乎是無限的,。細胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。1． 凍存細胞（1）選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染),，在凍存前1d換液,。（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數(shù),，使細胞密度達5×107／ml左右密度,，離心，去上清,。（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml,，小牛血清2ml，DMSO 1ml,，5.6%NaHCO3 0.1ml）,，按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸,。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,，可使冰點降低，使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外,。（4）分裝于無菌凍存管中,，每管加1.5m懸液。（5）旋好凍存管并仔細檢查,，一定要蓋緊,，做好標記。（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,，在30～40min時間內(nèi),，下降到液氮表面，再停30min后,，直接投入液氮中,。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內(nèi)水分透出,，太慢則促進冰晶形成,。操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷,。2. 復(fù)蘇細胞（1）從罐中取出凍存管,。（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動,，使其急速融化,，30～60s內(nèi)完成。（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后,，打開蓋子,，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液,。（4）低速離心(500～1000r／min) 5min,，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。（5）用培養(yǎng)液適當稀釋后,，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng),，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng),。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng),。凍存細胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達到107／ml,，在融后稀釋20倍時,，仍能保持5×105／ml數(shù)量。

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接種或傳代以后,，實驗者每天或至多間隔1～2d，要對細胞做常規(guī)性檢查,。觀察細胞形態(tài)和生長情況以及培養(yǎng)的pH變化,、有無污染等,。根據(jù)細胞動態(tài)變化，做換液或傳代處理,，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時采取措施,。1. 細胞形態(tài)　生長狀態(tài)良好的細胞，在一般顯微鏡下觀察時可見,，細胞透明度大,、折光性強、輪廓不清,。細胞生長不良時,，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡,、脂滴和其他顆粒狀物,，細胞之間空隙加大，細胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點,，如上皮細胞變成類上皮細胞等,。某些染料當細胞死亡時能透過變性的胞膜與解體的細胞核DNA結(jié)合，而令其著色,。因而常用臺盼藍(trypan blue) 鑒別細胞死活,，活細胞不著色，死細胞核呈藍色,。2. 細胞生長　初代培養(yǎng)或傳代的細胞懸液接種以后,，經(jīng)過長短不同的潛伏期后開始增殖。傳代細胞系,、胚胎組織或幼體組織一般在第二天即可見細胞生長,，一周內(nèi)便可連接成片,。接種細胞長滿瓶壁后,，應(yīng)及時做再培養(yǎng)。否則由于營養(yǎng)物消耗和代謝積累,，細胞即進入停止期或退化期,。此時細胞輪廓增強，細胞內(nèi)常出現(xiàn)顆粒狀堆積物,，為膨脹的線粒體,，細胞質(zhì)呈空泡化，細胞變圓,、粗糙,，嚴重時細胞從瓶壁脫落，只有及時再做傳代處理,，才能使細胞繼續(xù)生長繁殖,。3. 營養(yǎng)液　正常情況下,，培養(yǎng)液呈桃紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下,，細胞會脫落死亡,。當培養(yǎng)液酸化變黃時，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量,，需要更換新鮮培養(yǎng)液,。培養(yǎng)液中如加Hepes或用5％CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持相對穩(wěn)定。更換營養(yǎng)液的時間,，可依營養(yǎng)物的消耗而定,，細胞生長旺盛時2～3d換一次，生長緩慢時,，3～4d亦可,。要特別注意各種細胞對pH值要求是不一樣的。4. 微生物污染　微生物污染培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物后會出現(xiàn)pH值改變,，培養(yǎng)液呈現(xiàn)混濁狀,。細菌感染后，由于細菌的運動,，光鏡觀察可見有微閃光,；真菌感染則在鏡下見許多細絲狀菌絲，有時還密集有群集孢子,；支原體的污染需要借助一些檢測手段才可檢出,。細胞污染以后一般應(yīng)當廢棄，對于重要的細胞株,，可以參考相關(guān)專著,，介紹采取一些措施清除污染。比較重要的實驗,、珍貴的細胞,，至少由兩個實驗人員獨立培養(yǎng)操作，或由一個人分次(不同時)操作,。除培養(yǎng)實驗室的衛(wèi)生條件外,，空氣中的濕度與微生物污染關(guān)系密切。重要的,、周期長的實驗盡量安排在空氣濕度低的秋冬季進行,。