產品描述
　　Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒，本試劑盒采用一對支原體特異性引物,，用于對樣品的支原體基因組DNA進行PCR擴增,，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。試劑盒內同時含有內參對照，用于監(jiān)控PCR是否正常擴增,。

　　本試劑盒與MB Zell Shield 13-0050等產品相比更具優(yōu)勢,，替代性強，具體情況可詳見下文或咨詢銷售人員,。
　　本試劑盒是一種廣譜的支原體檢測試劑盒,，可以識別所有100多種至今已發(fā)現的支原體；能用于檢測一切可能含支原體的樣品,，比如：體外細胞培養(yǎng)的上清,；血清；各種體液,，如唾液,、尿液、鼻腔分泌物等,；其他液體樣品等,。具有100%支原體識別率、靈敏度*,、含內參條帶從而可以區(qū)分真陰性樣品和假陰性樣品、無需配套相對昂貴的熒光定量PCR儀等優(yōu)點,。
　　經多次測試,，本試劑盒有記錄可以識別在體外細胞培養(yǎng)中曾經報道出現的20種支原體，根據文獻報道,，這些支原體基本能占污染細胞的支原體種類的100%,。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans,、（3）M. arginini,、（4）M. hominis、（5）M. orale,、（6）M. salivarium,、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii,、（9）M. agalactiae,、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi,、（12）A. axanthum,、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae,、（15）M. arthritidis,、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum,、（19）M. canis,、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫; A.為Acholeplasma的縮寫）。

訂購信息

【注】：
以下試劑需要自行準備：①普通的Taq DNA 聚合酶（推薦使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version,，貨號：RR006A，已包含2.5 mM 的 dNTP）和相應的緩沖液,；② 2.5 mM的dNTP,；③DNA上樣緩沖液（推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號：AN34L047,，該緩沖液已含無毒核酸染料,，不需要接觸 EB 等致癌物質）。
運輸與保存條件
　　冰袋運輸,，-20℃保存,，可以保存五年。
使用方法
1.待測樣品的準備
取換液后培養(yǎng)2-3 d且匯合度在90%左右的細胞培養(yǎng)液上清（貼壁細胞）,。懸浮培養(yǎng)的細胞在換液傳代后,，生長2-3 d再取培養(yǎng)液進行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進行樣品的前處理：
方法一
（1）取 150μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內,，在普通臺式離心機上1000 rpm 低速離心5 min；
（2）上述離心上清液,，95 ℃加熱處理5 min（可以轉移到 PCR 管內,，在 PCR 儀上進行加熱處理），簡單離心（1000g,，5 s）后,，取上清進行檢測。
方法二（推薦本方法,，有高速離心機的的可選用本方法,，可以去PCR抑制物，準確性更高,。）
（1）根據濃縮倍數,，可以取100 - 1500μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，普通臺式離心機1000 rpm 離心5 min,，將離心后的上清轉移到另一個離心管內,，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續(xù)13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清,，用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推薦使用,，樣品可以長期保存）或者去離子水（樣品比較不穩(wěn)定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸,、沉淀（沉淀中含有支原體）,，吹吸均勻。
（3）該重懸后的樣品可以直接檢測,，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后,，樣品保存更穩(wěn)定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉移到PCR管內,，在PCR儀上進行加熱處理）,，簡單離心（1000g，5 s）后,，取上清進行檢測,。
【注】：
① 這里的細胞培養(yǎng)上清不是指細胞經*酶消化后的離心上清，而是指至少培養(yǎng) 2 d后的貼壁細胞培養(yǎng)液上清或懸浮細胞培養(yǎng)液,；
② 本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞,，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g,，該離心力下,，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會；
③ 收集的待測細胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測,，請放于-20℃或-80℃冰箱保存,；
④ 如果預期待測樣品支原體含量較少（比如低溫保存的血清,、臍帶血,、*mei、抗生素,、未使用的培養(yǎng)液,、生物制品、極個別細胞培養(yǎng)上清等）,，可以采取措施以提高檢測的靈敏度,，具體方法請看后文注意事項部分：如何提高本試劑盒檢測靈敏度。
2.PCR 體系的配制  
（1）按照25μL體系配制比例如下,。如果是多樣品檢測,，加兩個對照樣品后各組分總體積如下表。配制好的混合液,，按每管23μL分裝到0.2 mL的PCR管中,。

【注】：
① 總體積中多配制 6% 是為了防止移液導致誤差，以保證每個反應管中的反應液足量；
② 如果有條件,，PCR 體系的配制建議在冰上進行操作,；
③ 本試劑盒不推薦使用 2× 的 PCR mixture（內含 Taq 酶、緩沖液和 dNTP）,，建議使用Taq酶,、10×Taq 緩沖液和 dNTP 等試劑配制PCR體系；
④ 為了避免可能的污染,，收到的支原體引物和內參,，可以適當分裝（比如：每支 40μL）后冷凍保存；
⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶（前提是：陰性對照的 586 bp 內參條帶必須有一定亮度,，且穩(wěn)定性良好,，否則不能使用），酶,、去離子水的加入量需要根據其說明書進行調整,。
（2）加入待測樣品、陰性和陽性對照樣品,。樣品檢測管中加入2μL待測樣品,，陰性對照管加入2μL去離子水，陽性對照管加入2μL陽性支原體 DNA,。
【注】：
① 裝有陽性支原體 DNA 的螺口管開蓋之前,，低速離心或用手指捏住，用力甩一下即可,；
② 進行反應體系配制的房間,，與樣品前處理、加陽性對照DNA,、樣品DNA的房間建議分開,。
3.PCR 參數設置

4.PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳
　　配制含溴化乙錠（EB）的濃度為 1.5%的 DNA 瓊脂糖凝膠（推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號：AN34L047,，該產品預添加了無毒安全染料）,；當溴酚藍染料跑出上樣孔 3-4 cm時，停止電泳,，拍照,。
5.結果判斷  
PCR 擴增的結果有可能出現以下幾種情況：

　　支原體 PCR 擴增結果：586 bp 條帶為內參條帶，270 bp 左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會略有不同,，總體在 266-280 bp 之間,。注意：支原體特異條帶的大小不會超過該范圍,。超過該范圍的，就是雜帶?。?。隨著支原體 DNA 模板的增加，270 bp 左右的條帶會逐漸增強而 586 bp 的內參條帶會逐漸減弱,，甚至消失,。
　　泳道1：陰性對照或者沒有支原體污染的樣品；
　　泳道2：極重度支原體污染樣品,；
　　泳道3：重度污染樣品,；
　　泳道4：中度污染樣品；
　　泳道5：輕度污染樣品,；
　　泳道6：PCR 的擴增被細胞的代謝產物抑制,，導致擴增失敗。
　　M：DNA marker.
注意事項
1.設有陰性對照,，保證本試劑盒含有的支原體引物和內參以及整個反應體系正常,。
2.只有當陰性對照的結果沒有出現 270 bp 左右的支原體特異條帶時，其他樣品的檢測結果才是可信的,。
3.每次試驗陰性對照中 586 bp 的內參條帶都必須出現而且要有一定的亮度,，才說明試驗成功。如果陰性對照的內參條帶經常沒有出現或者非常弱,，說明試驗不成功,，這時可以采取以下幾個措施： a.請使用普通蒸餾水或去離子水。不能使用去內毒素的水,、DEPC 處理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水,，這幾種水都可能會抑制 PCR 擴增的效率。 b.請使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version（推薦,。貨號： RR006A,，可用 400 次）,。 c.可以嘗試增加 PCR 的循環(huán)數,，比如：由原來的 40 個循環(huán),，增加到 45 個循環(huán)。如果采取以上幾個措施后,，陰性對照的內參條帶仍然經常沒有出現或者非常弱,，請聯系廠家解決。
4.如果直接使用細胞培養(yǎng)液上清進行檢測,，而檢測結果顯示該樣品 586 bp 條帶和 270 bp 左右的條帶都沒有出現（如圖 1,，泳道 6）或者內參條帶非常微弱,，在排除 PCR試劑的問題后,說明該樣品含有抑制 PCR 擴增的代謝產物。
5.防 DNA 污染注意事項： a.強烈建議所有操作全部使用進口濾芯吸頭（比如：Axygen 濾芯吸頭）進行操作,，以免試劑被污染,。 b.“PCR 體系配制的房間、移液槍”（不要使用細胞培養(yǎng)室的移液槍?。┖汀癙CR 產物的電泳房間、移液槍”一定要分開,，不能在同一個房間進行，也不能使用相同的移液槍進行操作,。 c.PCR 產物是導致假陽性的主要原因，PCR 產物不要在 PCR 體系配制的房間中打開,。 d.樣品處理的房間和移液槍，如有條件,，建議也分開。 e.收到的支原體引物和內參,，可以分裝（比如 40 μL一支）后保存。
6.如發(fā)現細胞被支原體污染,，推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預防試劑盒，貨號：AC16L066,；以及EZ 水浴鍋抑菌劑，貨號：AC16L162 和 EZ 細胞房除菌劑,，貨號：AC16L143。產品詳情可咨詢銷售人員或見李記生物網站,。
7.支原體檢測樣品可以分成兩類：①用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動物細胞上清液,，由于該條件非常適合支原體生長,，培養(yǎng)數天后，支原體密度一般較高,，可達 10^7-9/mL,，可以直接檢測,。②低溫保存的血漿,、血清、臍帶血,、*酶、抗生素,、未使用的培養(yǎng)液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染,，支原體含量一般很少,，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來,。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮處理；（2）使用支原體液體培養(yǎng)基（必須同時接種不含jing氨酸和含jing氨酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基）培養(yǎng) 3-7 d后,，再進行檢測。具體方法請參考李記生物 Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒,，貨號：AC16L062 說明書中后的注意事項部分,。該方法速度較慢，需要 3-7 d,，但是可靠性高。
8.該產品主要用于細胞上清支原體污染檢測,，僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷,、治療等領域,。
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