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以下資料僅供參考：

蛋白質的定量測定（一）--凱氏定氮法

目的要求

（1）學習微量凱氏定氮法的原理,。

（2）掌握微量凱氏定氮法的操作方法,。

實驗原理

生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義，如蛋白質的含氮量約為16％,，測出含氮量則可推知蛋白含量,。生物材料總氮量的測定，通常采用微量凱氏定氮法,。凱氏定氮法由于具有測定準確度高,，可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點，因而被*為是測定食品,、飼料,、種子、生物制品,、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。其原理如下：

1. 消化：有機物與濃硫酸供熱,，使有機氮全部轉化為無機氮——硫酸銨,。為加快反應，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物,；前者為催化劑,，后者可提高硫酸沸點。這一步約需30min至1h,，視樣品的性質而定,。

2. 加堿蒸餾：硫酸銨與NaOH（濃）作用生成（NH4）OH, 加熱后生成NH3, 通過蒸餾導入過量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用過量標準HCl吸收NH3,，剩余的酸可用標準NaOH滴定,，由所用HCl摩爾數(shù)減去滴定耗去的NaOH摩爾數(shù)，即為被吸收的NH3摩爾數(shù),。此法為回滴法,，采用甲基紅衛(wèi)指示劑。HCl＋NaOHNaCl +H2O

本法適用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量測定。

1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應室 8. 反應室外殼 9. 夾子 10. 反應室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網

圖3.4 微量凱氏蒸餾裝置示意圖

 試劑和器材

一,、試劑

濃硫酸,；30％過氧化氫溶液；10 M氫氧化鈉,；0.01M的標準鹽酸,；標準硫酸銨（0.3mg氮/mL）。

催化劑：硫酸銅：硫酸鉀＝1：4混合,，研細,。

指示劑：0.1％甲基紅乙醇溶液。

二,、測試樣品

牛血清白蛋白,。

三、器材

微量凱氏定氮儀,；移液管1mL（×3）,；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）; 燒杯200mL（×2）,；量筒10mL（×1）,；三角燒瓶150mL（×4）；凱氏燒瓶50mL（×4）,，吸耳球（×1）,；電爐；分析天平,。

操作方法

一,、樣品處理

稱取牛血清白蛋白50mg，加入2個凱氏燒瓶中,，另2個凱氏燒瓶為空白對照,，不加樣品。分別在每個凱氏燒瓶中加入約500mg硫酸鉀－硫酸銅混合物,，再加5 mL濃硫酸,。

二、消化

將以上4個凱氏燒瓶置于通風櫥中電爐上加熱,。在消化開始時應控制火力,，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完,，硫酸開始分解并放出SO2白煙后,，適當加強火力，繼續(xù)消化,使瓶內液體微微沸騰,，大約維持2 ~ 3h,。待消化液變成褐色后,，為了加速完成消化，可將燒瓶取下,，稍冷,，將30％過氧化氫溶液1 ~ 2滴加到燒瓶底部消化液中,，再繼續(xù)消化,，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍綠色,，消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中,，并以蒸餾水洗滌燒瓶數(shù)次,，將洗液并入容量瓶中，定容備用,。

三,、蒸餾

1. 蒸餾器的洗滌

蒸氣發(fā)生器中盛有加有數(shù)滴H2SO4的蒸餾水和數(shù)粒沸石。加熱后,，產生的蒸汽經貯液管,、反應室至冷凝管，冷凝液體流入接受瓶,。每次使用前,，需用蒸汽洗滌10分鐘左右（此時可用一小燒杯承接冷凝水）。將一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端,，使冷凝管管口插入液體中,，繼續(xù)蒸餾1 ~ 2分鐘，如硼酸液顏色不變,，表明儀器已洗凈,。

2. 消化樣品及空白的蒸餾

取50mL 錐形瓶數(shù)個，各加25mL 0.01M標準HCl和1 ~ 2滴指示劑,，用表面皿覆蓋備用,。

取2mL 稀釋消化液，由小漏斗加入反應室,。將一個裝有0.01M標準HCl和指示劑的錐形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸沒在液體內,。

用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液,，倒入小漏斗，讓NaOH溶液緩慢流入反應室,。尚未*盡時,，加緊夾子，向小漏斗加入約5mL蒸餾水,，同樣緩緩放入反應室,，并留少量水在漏斗內作水封,。加熱水蒸氣發(fā)生器，沸騰后,，關閉收集器活塞,。使蒸汽沖入蒸餾瓶內，反應生成的NH3逸出被吸收,。待氨已蒸餾*,，移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，并用少量蒸餾水冷凝管口,。取下錐形瓶,，以0.01M NaOH標準溶液滴定。記下所耗去的體積,。

3. 蒸餾后蒸餾器的洗滌

蒸餾完畢后,，移取熱源，夾緊蒸汽發(fā)生器和收集器間的橡皮管,，此時由于收集器溫度突然下降,，即可將反應室殘液吸至收集器。

• 標準樣品的測定

在蒸餾樣品及空白前,，為了練習蒸餾和滴定操作,，可用標準硫酸銨試做實驗2 ~ 3次。

標準硫酸銨的含氮量是0.3mg/mL,，每次實驗取2.0mL,。

四、計算

樣品的含氮量（mg/mL）=

若測定的蛋白質含氮部分只是蛋白質（如血清）,，則：

樣品中蛋白質含量（mg/mL）＝

式中：A為滴定空白用去的NaOH平均mL數(shù),，B為滴定樣品用去的NaOH平均mL數(shù)，V為樣品的mL數(shù),，0.01 NaOH的摩爾濃度,，14為氮的原子量，6.25為系數(shù)（蛋白質的平均含氮量為16％,，由凱氏定氮法測出含氮量,，再乘以系數(shù)6.25即為蛋白質量），N為樣品的稀釋倍數(shù),。

注意事項

（1）必須仔細檢查凱氏定氮儀的各個連接處,，保證不漏氣。

（2）凱氏定氮儀必須事先反復清洗,，保證潔凈,。

（3）小心加樣，切勿使樣品沾污口部,、頸部,。

（4）消化時,，須斜放凱氏燒瓶（45o左右）?；鹆ο刃『蟠?，避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上,。

（5）蒸餾時,，小心加入消化液。加樣時將火力擰小或撤去,。蒸餾時,，切記火力不穩(wěn)，否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象,。

（6）蒸餾后應及時清洗定氮儀,。