無熒光性新型SHG成像用染料

Ap3, SHG成像染料

Ap3是一種無熒光性SHG染料,，在SHG信號成像中不會發(fā)出障礙性熒光,。它與常規(guī)的熒光性膜染色染料不同，可以只觀察細(xì)胞膜的信號,，因此能夠用于分析細(xì)胞膜的準(zhǔn)確位置,。另外，由于SHG信號強(qiáng)度和膜電位相關(guān),，因此還能用于膜電位的成像,。

※ 本產(chǎn)品僅供科研用，不可作其他用途,。

※ 本產(chǎn)品基于慶應(yīng)義塾大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教室以及筑波大學(xué) 數(shù)理物質(zhì)系（學(xué)際物質(zhì)科學(xué)研究中心）的研究成果,，由funakoshi進(jìn)行商品化并銷售,。

※ Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).

※ 慶應(yīng)義塾大學(xué)醫(yī)學(xué)部 藥理學(xué)教室 塗谷老師的相關(guān)采訪文章，請復(fù)制鏈接訪問 https://www.funakoshi.co.jp/contents/65872,。

使用SHG專用染料對細(xì)胞膜現(xiàn)象進(jìn)行成像

利用雙光子現(xiàn)象之二次諧波產(chǎn)生（Second Harmonic Generation: SHG）

在顯微鏡下測量細(xì)胞膜形態(tài)和變化

慶應(yīng)義塾大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教室 塗谷睦生 老師

【背景】

細(xì)胞膜分隔細(xì)胞內(nèi)外,，可以作為在其周邊產(chǎn)生的電信號和化學(xué)信息的傳遞場所，因此在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞中起著十分重要的作用,。但是,，由于其結(jié)構(gòu)的精細(xì)和復(fù)雜性等，難以進(jìn)行生理學(xué)上的分析,。研究發(fā)現(xiàn),，對細(xì)胞膜具有高親和力的染料在細(xì)胞膜中會發(fā)出強(qiáng)烈的SHG信號，由于該信號會根據(jù)膜電位而變化,，因此研究認(rèn)為,，SHG成像在細(xì)胞膜的標(biāo)記及其電位變化的分析等方面非常有效。

【無熒光性SHG專用染料Ap3】

Ap3是為了SHG成像而開發(fā)和合成的一種新型的無熒光性SHG專用染料,，使用這種染料可實(shí)現(xiàn)觀察其他熒光染料的同時(shí)觀測,。利用這一點(diǎn)，使用Ap3進(jìn)行SHG成像可以觀察到響應(yīng)神經(jīng)活動引起的膜電位變化,，同時(shí)通過鈣敏感性染料的熒光成像,，還可以觀察到膜附近鈣濃度的變化。研究表明,，使用Ap3進(jìn)行的成像,，由于光照射引起的信號衰減和細(xì)胞毒性非常低。因此利用Ap3能夠可視化細(xì)胞膜,，捕捉膜電位的變化,，還可能同時(shí)對熒光蛋白的動態(tài)和報(bào)告熒光染料的信號變化進(jìn)行長時(shí)間成像。因而使用Ap3對腦細(xì)胞,、包括肌細(xì)胞在內(nèi)的其他興奮性細(xì)胞的生理學(xué)分析,，或使用各種系統(tǒng)的離子通道的功能分析等的應(yīng)用方面?zhèn)涫芷诖?/span>

【展望】

除上述以外，SHG成像還可以對細(xì)胞膜的損傷和脂質(zhì)成分,，以及核酸或蛋白等生物分子的結(jié)構(gòu)變化等多種生命現(xiàn)象進(jìn)行高靈敏度檢測,。利用具有這種特殊能力的普通多光子顯微鏡系統(tǒng)，即可輕松地進(jìn)行SHG成像,，而且通過擴(kuò)展專用染料的應(yīng)用性,，相信SHG成像作為生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的新型工具會有更進(jìn)一步的發(fā)展。

◆特點(diǎn)

●　Ap3是SHG成像的專用染料,。除 SHG信號外,，不會發(fā)出熒光

●　Ap3無熒光性， SHG成像的同時(shí)還能進(jìn)行鈣成像等熒光性成像的多模式成像

●　Ap3是一種光穩(wěn)定性高的化合物

●　Ap3具有極低的光毒性,，對細(xì)胞的損傷小

●　推薦光源：鈦藍(lán)寶石激光（波長標(biāo)準(zhǔn)：950 nm）

※ 在SHG成像中,，需要雙光子激發(fā)顯微鏡,、SHG信號用濾光片（例如465-485 nm的帶通濾光片）

※ 在SHG成像的觀察中，物鏡的另一側(cè)（正置顯微鏡時(shí)為下方）需要檢測系統(tǒng),。另外，在檢測系統(tǒng)一側(cè)建議使用具有光電倍增管（PMT）的顯微鏡,。

◆操作方法要點(diǎn)

1. 在玻璃底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞,；

2. 向細(xì)胞中添加終濃度為20 μM的Ap3溶液；

3. 使用雙光子激發(fā)顯微鏡進(jìn)行觀察,。

◆應(yīng)用實(shí)例1

■　Ap3的SHG信號和無熒光性

950 nm激光照射時(shí),，通過Ap3可觀察到 SHG 信號，但未觀察到熒光信號,。

■　腦切片中SHG成像的膜電位變化

A：電壓固定時(shí)SHG信號的膜電位敏感性

B：動作電位依賴性SHG信號變化（左）和通過膜片鉗測量的電位變化（右）

Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).

■　同時(shí)測量腦切片中SHG成像的膜電位變化和熒光成像的鈣濃度

在腦切片中反復(fù)施加動作電位時(shí)（左,；比例尺20 mV，5 s）,，觀察Ap3的SHG信號和熒光性鈣檢測試劑Rhod-2的雙光子熒光信號（TPF）（右）,。在成像中同時(shí)測量的膜電位變化和鈣濃度變化。

Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).

◆應(yīng)用實(shí)例2

■　比較多模式雙光子顯微鏡下的細(xì)胞膜選擇性SHG成像和細(xì)胞膜熒光成像

用Ap3對表達(dá)細(xì)胞膜觀察用膜錨定GFP的細(xì)胞進(jìn)行染色,，同時(shí)可視化在950 nm飛秒激光照射下GFP的雙光子熒光（TPF,，綠色）和Ap3的SHG（洋紅色）信號。

由于GFP信號不僅從細(xì)胞膜,，還會從囊泡等許多細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)中發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,，因此難以準(zhǔn)確地識別出細(xì)胞膜的位置。與之相對的,，Ap3的 SHG 信號只能從細(xì)胞膜發(fā)出,，從而可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的選擇性成像和位點(diǎn)的準(zhǔn)確識別。

Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下細(xì)胞膜正下方的囊泡動態(tài)和肌動蛋白

在表達(dá)GFP標(biāo)記肌動蛋白的細(xì)胞中,，分別用紅色熒光標(biāo)記Dextran染色胞吞后的囊泡,，用Ap3染色細(xì)胞膜，同時(shí)利用多模式雙光子顯微鏡進(jìn)行可視化,。

Ap3的SHG信號具有細(xì)胞膜特異性,，而且可以與熒光信號*分離，因此能夠通過Ap3的SHG信號準(zhǔn)確識別細(xì)胞膜的位置,，從而準(zhǔn)確地測量從細(xì)胞膜到肌動蛋白骨架的距離,。

Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下質(zhì)膜正下方的囊泡動態(tài)和微管蛋白

在經(jīng)過微管蛋白可視化試劑染色的細(xì)胞中，分別用紅色熒光標(biāo)記Dextran標(biāo)記胞吞后的囊泡,，用Ap3標(biāo)記細(xì)胞膜,，利用多模式雙光子顯微鏡進(jìn)行可視化。

Ap3的SHG信號具有細(xì)胞膜特異性,，而且可以與熒光信號*分離,，因此能夠通過Ap3的SHG信號準(zhǔn)確識別細(xì)胞膜的位置,，而且可以測量從細(xì)胞膜到微管，以及細(xì)胞膜正下方囊泡移動的準(zhǔn)確距離,。

Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

◆產(chǎn)品列表