JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒

產(chǎn)品描述
　　線粒體膜電位降低是細胞早期凋亡的一個標志,，它發(fā)生在細胞膜上的磷酯酰絲氨酸外翻與caspase水解酶激活之前,。當線粒體膜通透性發(fā)生改變時,，膜電位會降低。這種膜電位的改變是由于 Bax二聚體的形成和 Bid, Bak, Bad的激活,，從而誘導線粒體膜形成孔隙造成的,。當這些促凋亡蛋白被激活時,，線粒體同時也將細胞色素 C 釋放到細胞質(zhì)中,。
　　JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△ Ψm的理想熒光探針，它可以檢測細胞,、組織或純化的線粒體膜電位,。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中,，形成聚合物,，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時,，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,，此時 JC-1 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光,。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到膜電位的下降,，同時也可以用 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。
　　JC-1單體的大激發(fā)波長為 510 nm,，大發(fā)射波長為527 nm,；JC-1 聚合物的大激發(fā)波長為 585 nm，大發(fā)射波長為 590 nm。JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒操作簡單快速,，可以通過流式細胞儀,，熒光顯微鏡或熒光酶標儀檢測。
訂購信息

產(chǎn)品組分

保存方法
　　組分A,、B需4℃避光冷藏,，并盡量避免反復凍融，組分C﹣20℃保存,。有效期見外包裝,。
光譜特性
Ex/Em：
510/527 nm（單體物，綠色）,；
585/590 nm（聚合物，紅色）,。
操作步驟
1.試劑準備：
配制 JC-1 工作液
按如下方案配置1mL 1×JC-1染色工作液：取10 µL 100×JC-1染色液,，加入到890 µL滅菌的diH2O中，渦旋混勻,，向上述混合液中加入100 µL 10× Assay Buffer,，渦旋混勻，即可得到1×JC-1染色液,。
【注】：
（1）配置體積可同比例擴大或縮小,。
（2）不建議直接用1×Assay Buffer稀釋100×JC-1染色液，可能會出現(xiàn)沉淀,。
配制1× Assay Buffer
用 diH2O 按 10：1 稀釋檢測緩沖液（如1 mL 10×assay buffer + 9 mL diH2O）,。
2.流式細胞染色方案：
細胞染色
開始實驗之前，請確保JC-1和CCCP溶液已恢復至室溫,。
（1）按實驗所需,，在培養(yǎng)板中接種細胞（懸浮細胞不要超過106個/mL）。
（2）陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液）,，37℃孵育20 min,。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同,，需自行參考相關文獻資料確定,。
（3）對于貼壁細胞，染色前先進行消化處理,，將其制成細胞懸液,，0.5 mL裝于離心管中。
（4）室溫下400 x g,，離心5 min,。
（5）除去上清。
（6）用0.5 mL的 JC-1 工作液重懸細胞。
（7）置于37℃細胞培養(yǎng)箱,，孵育 15 min,。
（8）室溫下400 x g，離心 5 min,，去除上清,。
（9）用 2 mL 的 PBS 緩沖液、培養(yǎng)基或1× Assay Buffer重懸細胞,，離心去除上清,，重復一次。
（10）用 0.5 mL的 PBS ,、培養(yǎng)基或1× Assay Buffer重懸細胞,，用流式細胞儀檢測分析。
流式細胞儀定量分析
對于正常細胞,，在PE或PI（FL2）通道可以檢測到線粒體內(nèi)的JC-1紅色聚集物,；對于凋亡細胞，在FITC（FL1）通道可以檢測到JC-1綠色單體物,。
3.熒光顯微鏡染色方案：
懸浮細胞染色
（1）參照流式細胞儀染色方案,，對細胞進行染色。
（2）用0.3 mL的 PBS或培養(yǎng)基重懸細胞,。
貼壁細胞染色
（1）在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板上接種細胞,。
（2）陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min,。對于特定的細胞,，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料確定,。
（3）去除培養(yǎng)基,，加入JC-1工作液使其覆蓋細胞表面。
（4）置于37℃細胞培養(yǎng)箱,，孵育 15 min,。  
（5）除去染液，用PBS 緩沖液,、培養(yǎng)基或1× Assay Buffer清洗一次細胞,。
（6）用熒光顯微鏡觀察分析。
熒光顯微鏡成像
采用可以同時檢測熒光素和羅丹明,，或者熒光素與Texas Red 的雙通道濾波器熒光顯微鏡觀察細胞,。對于正常細胞，擁有完整的線粒體膜電位,，線粒體在590 nm處發(fā)出紅色熒光,，細胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光,；對于凋亡或壞死的細胞，染料以單體形式存在,，在530 nm處發(fā)出綠色熒光,。
4.測定熒光相對比率染色方案：
（1）按照實驗要求在96孔板中接種細胞。
（2）陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液）,，37℃孵育20 min,。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同,，需自行參考相關文獻資料確定,。
（3）根據(jù)熒光顯微鏡細胞染色方案對細胞進行染色處理。
（4）用熒光酶標儀檢測熒光值（紅色熒光：Ex/Em=550/600 nm,；綠色熒光 Ex/Em=485/535 nm）,。
（5）計算紅綠熒光比值。
（6）與正常細胞相比,，在凋亡或壞死細胞中,，紅綠熒光比值會降低。
注意事項
　　該產(chǎn)品*于科學實驗研究使用,，不得用于臨床診斷,、治療等領域,。