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本項目的實驗?zāi)康氖桥囵B(yǎng)人多能干細(xì)胞hiPSC并通過電鏡觀察，熒光免疫法,，流式細(xì)胞法來進行鑒定,，以上結(jié)果顯示，本公司培養(yǎng)人多能干細(xì)胞hiPSC鑒定正確,，可供科研使用,。

1.專用培養(yǎng)基配制（500 mL）

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍,。

2. 參考表1在生物安全柜中,，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，之后置于4℃儲存,，封口膜封好后2周內(nèi)使用,。

3. 有初培養(yǎng)需擴建的需求，建議先配置100 mL，保證2周內(nèi)使用完畢,。

可根據(jù)實際用量將hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分裝后冷凍保存,。具體配置比例可參考表3的配置說明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B凍融總次數(shù)不能超過2次,。

2.Matrigel鋪板

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度,，而是以Dilution Factor表示,，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板,，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98,。

2. 準(zhǔn)備18個無菌1.5 mL EP管，標(biāo)記Matrigel日期,、操作人,；1mL無菌吸頭；EP管架,，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時,。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍，當(dāng)Matrigel解凍即可開始分裝,。

注：在解凍時,，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近,。

4. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒,，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架,、1mL吸頭放置于生物安全柜上,。

5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中,，并置于冰上,。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存,。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中,，準(zhǔn)備4個6孔板，標(biāo)記Matrigel,、批號,、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時,，取出一支冷凍的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解凍至化凍,。

3. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel,、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上,。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻,。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻,。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中,，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用,，或置于4℃冷藏過夜,，兩周內(nèi)使用。

圖1. hESC/iPSC專用培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)hiPSC細(xì)胞形態(tài)圖：（A）和（C）分別為hiPSC細(xì)胞培養(yǎng)第2和4天時低倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖示,，（B）和（D）為培養(yǎng)至第2和4天時的高倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖。

10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜,，避免震蕩搖晃細(xì)胞,，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C,，水平十字搖晃6孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì),。

注：① 加hESC/iPSC專用培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細(xì)胞1-2次,，不能超過2次,，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象,，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長消化時間（< 10min）。

圖2：消化hiPSC細(xì)胞不同時間形態(tài)圖：（A）消化8 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化9 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖,。

②hiPSC細(xì)胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min）,，所以收集接種細(xì)胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔（六孔板）。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液,，加入預(yù)溫的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔,。

13. 在6孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次,、傳代比例,、日期、操作人,。將步驟9獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻,，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細(xì)胞的損傷,，可以將步驟9獲得的細(xì)胞懸液收集至2mL離心管,，輕柔顛倒混勻細(xì)胞1-2次；再按照傳代比例接種,。

14. 接種后,，水平十字搖勻6孔板三次,，置于37℃，5% CO2濃度,，飽和濕度的培養(yǎng)箱中,， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜,。

15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC專用培養(yǎng)基,，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存,。

備注：以上操作全部以6孔板為例

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,，培養(yǎng)液是否有漏液,、渾濁等現(xiàn)象,，干冰運輸?shù)募?xì)胞檢查干冰是否揮發(fā)，細(xì)胞是否解凍,，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系,。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息,，如細(xì)胞形態(tài),、所用培養(yǎng)基、血清比例,、所需細(xì)胞因子等,，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題,，責(zé)任由客戶自行承擔(dān),。

3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復(fù)蘇細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，?xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況,，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決,。

5. 該細(xì)胞僅供科研使用。