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本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖桥囵B(yǎng)人多能干細(xì)胞hiPSC并通過(guò)電鏡觀察,，熒光免疫法,，流式細(xì)胞法來(lái)進(jìn)行鑒定，以上結(jié)果顯示,，本公司培養(yǎng)人多能干細(xì)胞hiPSC鑒定正確,，可供科研使用。

1.專用培養(yǎng)基配制（500 mL）

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B,，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍,。

2. 參考表1在生物安全柜中，使用無(wú)菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC專用培養(yǎng)基,，之后置于4℃儲(chǔ)存,，封口膜封好后2周內(nèi)使用。

3. 有初培養(yǎng)需擴(kuò)建的需求,，建議先配置100 mL,，保證2周內(nèi)使用完畢。

可根據(jù)實(shí)際用量將hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分裝后冷凍保存,。具體配置比例可參考表3的配置說(shuō)明,。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B凍融總次數(shù)不能超過(guò)2次。

2.Matrigel鋪板

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號(hào)354277的Matrigel,，操作說(shuō)明中不標(biāo)注蛋白濃度,，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL,，則表明278 μL可包被4塊6孔板,，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98,。

2. 準(zhǔn)備18個(gè)無(wú)菌1.5 mL EP管,，標(biāo)記Matrigel日期、操作人,；1mL無(wú)菌吸頭,；EP管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時(shí),。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過(guò)夜解凍,，當(dāng)Matrigel解凍即可開(kāi)始分裝。

注：在解凍時(shí)，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落,，切勿放在靠近冰箱門(mén)附近,。

4. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒，將解凍過(guò)的Matrigel,、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架,、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel,，無(wú)菌分裝于各個(gè)1.5 mL EP管中,，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時(shí)需要更換吸頭,。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存,。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準(zhǔn)備4個(gè)6孔板,，標(biāo)記Matrigel,、批號(hào)、日期和操作人,。

2. 1 mL無(wú)菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時(shí),，取出一支冷凍的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解凍至化凍。

3. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒,，將解凍過(guò)的Matrigel,、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過(guò)的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻,。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12,，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個(gè)六孔板中,，輕輕搖晃混勻,。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時(shí)后即可使用，或置于4℃冷藏過(guò)夜,，兩周內(nèi)使用,。

圖1. hESC/iPSC專用培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)hiPSC細(xì)胞形態(tài)圖：（A）和（C）分別為hiPSC細(xì)胞培養(yǎng)第2和4天時(shí)低倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖示，（B）和（D）為培養(yǎng)至第2和4天時(shí)的高倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖,。

10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜,，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution,。

11. 及時(shí)加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C,，水平十字搖晃6孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì)。

注：① 加hESC/iPSC專用培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時(shí),，可輕柔吹打細(xì)胞1-2次,，不能超過(guò)2次，避免反復(fù)吹打,；有部分細(xì)胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象,，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長(zhǎng)消化時(shí)間（< 10min）。

圖2：消化hiPSC細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)圖：（A）消化8 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化9 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖,。

②hiPSC細(xì)胞不能長(zhǎng)時(shí)間處于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min）,，所以收集接種細(xì)胞時(shí)操作必須快速,以及最好一次操作不要超過(guò)4孔（六孔板）。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液,，加入預(yù)溫的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔,。

13. 在6孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次,、傳代比例,、日期、操作人,。將步驟9獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻,，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對(duì)細(xì)胞的損傷,，可以將步驟9獲得的細(xì)胞懸液收集至2mL離心管,，輕柔顛倒混勻細(xì)胞1-2次；再按照傳代比例接種,。

14. 接種后,，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃,，5% CO2濃度,，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次,，培養(yǎng)過(guò)夜,。

15. 18-24小時(shí)后更換新hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，此后每天換液,，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存,。

備注：以上操作全部以6孔板為例

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,，培養(yǎng)液是否有漏液,、渾濁等現(xiàn)象，干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞檢查干冰是否揮發(fā),，細(xì)胞是否解凍,，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū),，了解細(xì)胞相關(guān)信息,，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基,、血清比例,、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致,，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題,，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng),。

4. 建議客戶復(fù)蘇細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流,。由于運(yùn)輸?shù)脑?，?xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,，告知細(xì)胞的具體情況,，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問(wèn)題解決,。

5. 該細(xì)胞僅供科研使用。