本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清,，血漿及相關(guān)液體樣本中登革熱抗體（DF-Ab）,。

實(shí)驗(yàn)原理：

  本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中人登革熱抗體（DF-Ab）。用純化的人登革熱抗體（DF-Ab）抗原包被微孔板，制成固相抗原,，可與樣品中人登革熱抗體（DF-Ab）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的人登革熱（DF-Ab）抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較,，從而判定標(biāo)本中人登革熱抗體（DF-Ab）的存在與否,。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：

1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔,、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）

2. 加樣：分別在陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。 

7. 溫育：操作同3,。

8. 洗滌：操作同5,。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘

10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

結(jié)果判定：

  試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10

  臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

  陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為人登革熱抗體（DF-Ab）陰性

  陽(yáng)性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為人登革熱抗體（DF-Ab）陽(yáng)性

注意事項(xiàng)

1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。

4． 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

5．底物請(qǐng)避光保存,。

6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。終止液為2M的硫酸,，使用時(shí)必須注意安全。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：,；2-8℃,。

2．有效期：6個(gè)月