大鼠可溶性細胞粘附分子1（sICAM-1）ELISA試劑盒說明書

本試劑僅供研究使用       細胞粘附分子1試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關液體樣本中可溶性細胞粘附分子1（sICAM1）含量,。

細胞粘附實驗原理：

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （sVCAM-1）水平。用純化的大鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （sVCAM-1）抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入可溶性血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （sVCAM-1）,，再與HRP標記的可溶性血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （sVCAM-1）抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的可溶性血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （sVCAM-1）呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中大鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （sVCAM-1）濃度。

細胞粘附試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心,。

2.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA,、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應該再次離心。

3.尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。

4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。

5.組織標本：切割標本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/font>2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用,。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔,，在*、第二孔中分別加標準品100μl,，然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻,；然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五,、第六孔中，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為360μg/L，240μg/L ,，120μg/L,，60μg/L， 30μg/L）,。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外,。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5,。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘. 

10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未用完,，板條應裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。

3． 各步加樣均應使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5． 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存,。

7． 嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理,。

9． 本試劑不同批號組分不得混用,。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準,。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標，    

在坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD      

值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值      

代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.92以上。

2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和15% 

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：,；2-8℃,。

2．有效期：6個月細胞粘附分子1（sICAM-1）ELISA試劑盒說明書