腦啡肽酶2試劑盒elisa說明書

標(biāo)本要求:

1．標(biāo)本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

樣本處理及要求：

1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體

積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

實驗原理:

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中血清素/血清胺(ST)水平,。用純化的血清素/血清胺(ST)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST),，再與HRP標(biāo)記的血清素/血清胺(ST)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過徹di洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶S的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的血清素/血清胺(ST)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度,。

試劑盒組成 :

1,、30倍濃縮洗滌液 20ml×1瓶 7 終止液 6ml×1瓶

2、酶標(biāo)試劑 6ml×1瓶 8 標(biāo)準(zhǔn)品（160pg/ml） 0.5ml×1瓶

3,、酶標(biāo)包被板 12孔×8條 9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1瓶

4,、樣品稀釋液 6ml×1瓶 10 說明書 1份

5、顯色劑A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2張  

6,、顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1個

操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。 

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5,。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

計算：

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差,。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

6．底物請避光保存,。

7．嚴(yán)格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

保存條件及有效期:

1．試劑盒保存：,；2-8℃,。

2．有效期：6 個月。