分光光度計是一種常規(guī)的實驗室分析儀器,。可廣泛用于無機物,、有機物的定性、定量分析中，在科研,、制藥、化工,、環(huán)保,、衛(wèi)生、防疫等領域中發(fā)揮重要的作用
　　分光光度計的簡單原理　
　　分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,，通過系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收,，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。
　　核酸的定量
　　核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA,。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應的樣品濃度。測試前,，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液,。然而，實驗并非一帆風順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者zui頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
　　事實上,，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準確度和度,。如的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,，都是正常的,。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計的測試范圍）。zui后是操作因素,，如混合要充分,，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值,；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達到比色杯要求的zui小體積等多個操作事項。
　　除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A360/A380的比值，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A360表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸,。　　
　　蛋白質的直接定量（UV法）
　　這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白。選擇Warburg公式,，光度計可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度,。蛋白質測定過程非常簡單,，先測試空白液，然后直接測試蛋白質,。由于緩沖液中存在一些雜質,，一般要消除320nm的“背景”信息，設定此功能“開”,。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5之間,。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時,，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象,。事實上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩(wěn)定,。蛋白質直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質,。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單,；但是容易受到平行物質的干擾,，如DNA的干擾；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高,。