考馬斯亮藍染色測定蛋白質(zhì)含量

一、實驗原理

考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）測定蛋白含量存在著兩種不同顏色形式,，紅色和藍色,。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變藍色形式,，zui大光吸收由465nm變成595nm,。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi),，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’s law）,，因此可以通過測定染料在595nm處吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。本法測定范圍為10~100µg蛋白質(zhì),。

由于該法簡單,、迅速、干擾物質(zhì)少,、重復(fù)性好,、靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測定,。

二,、實驗用品

(一)器材

    (1) 722分光光度計,。

    (2) 微量進樣器,。

    (3) 移液管（0.1ml及5ml）。

    (4) 試管及試管架,。  

(二 ),、試劑

     (1)標準蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清白蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6測定蛋白質(zhì)含量,，再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白質(zhì)溶液,。

     (2)考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸,，用蒸餾水稀釋至1000ml,，濾紙過濾。zui終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G-250,，4.7%（W/V）乙醇,，8.5%（W/V）磷酸。

    (三)材料

         末知蛋白質(zhì)溶液,，要求蛋白質(zhì)濃度范圍為0.1~5mg/ml,，若濃度過度時，需用0.15mol/LNaCl溶液適當稀釋,。 

三,、實驗程序

  （一）操作方法

   1.標準法制作標準曲線

    取14支試管，分兩組按表1-1平行操作,。

以OD595為縱坐標,標準蛋白為橫坐標,，在坐標紙上繪制標準曲線。

 2.微量法制作標準曲線

    取12支試管,，分兩組按表1-2平行操作,。

3.末知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定 

  測定方法同上,，取合適的末知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi),，根據(jù)所測定的OD595值,，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出末知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）,。