考馬斯亮藍染色測定蛋白質(zhì)含量
一、實驗原理
考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)測定蛋白含量存在著兩種不同顏色形式,,紅色和藍色,。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變藍色形式,,zui大光吸收由465nm變成595nm,。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi),,蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律(Beer’s law),,因此可以通過測定染料在595nm處吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。本法測定范圍為10~100µg蛋白質(zhì),。
由于該法簡單,、迅速、干擾物質(zhì)少,、重復(fù)性好,、靈敏度高,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測定,。
二,、實驗用品
(一)器材
(1) 722分光光度計,。
(2) 微量進樣器,。
(3) 移液管(0.1ml及5ml)。
(4) 試管及試管架,。
(二 ),、試劑
(1)標準蛋白質(zhì)溶液:結(jié)晶牛血清白蛋白,預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6測定蛋白質(zhì)含量,,再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白質(zhì)溶液,。
(2)考馬斯亮藍試劑:考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,,用蒸餾水稀釋至1000ml,,濾紙過濾。zui終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍G-250,,4.7%(W/V)乙醇,,8.5%(W/V)磷酸。
(三)材料
末知蛋白質(zhì)溶液,,要求蛋白質(zhì)濃度范圍為0.1~5mg/ml,,若濃度過度時,需用0.15mol/LNaCl溶液適當稀釋,。
三,、實驗程序
(一)操作方法
1.標準法制作標準曲線
取14支試管,分兩組按表1-1平行操作,。
以OD595為縱坐標,標準蛋白為橫坐標,,在坐標紙上繪制標準曲線。
2.微量法制作標準曲線
取12支試管,,分兩組按表1-2平行操作,。
3.末知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定
測定方法同上,,取合適的末知樣品體積,使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi),,根據(jù)所測定的OD595值,,在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量,從而計算出末知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/ml),。
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