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堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定

來源:北京來亨科學儀器有限公司   2016年07月14日 17:00  

堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定

 

一、實驗原理

       堿性磷酸酶(alkaline phosphatase   EC 3.1.3.1簡稱為ALPase)廣泛存于微生物界和動物界,。ALPase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應,,產(chǎn)生無機磷酸和相應的醇、酚或糖,。它也可以催化磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應,,磷酸基團從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上,。在磷的生物和化學循環(huán)過程中,,ALPase起了及其重要的作用。在生物體內(nèi)ALPase與磷的代謝直接相關(guān),,參與磷與鈣物質(zhì)的消化,、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化過程,。ALPase的作用zui適PH在堿性區(qū)域,,一般在PH9.0~10.5范圍內(nèi)。Mg2+對該酶的活力有顯著的激活使用,。

 

       為了獲得好的提取效果,,在酶的制備過程,特別應注意以下幾點:

       1.選取來源豐富,、酶含量高的新鮮材料,。提取工作應在獲得材料后立刻開始,否則應在低溫下保存,。

       2.用鹽分級沉淀是一種應用非常廣泛的方法,。碳酸銨是zui常用的鹽。操作時,,要注意保持緩沖液的合適PH值和溫度,。在加碳酸銨時需事先將其研細,需緩慢加入并及時攪拌溶解,,盡量防止泡沫形成,,以免酶蛋白在溶液中表面變性。鹽析生成的沉淀,,要靜置20min以上,,以使沉淀*,然后方可時行離心分離,。

      3.有機溶劑沉淀法也常用于蛋白質(zhì)的分離提純。丙酮和乙醇是使用的兩種有機溶劑,。應注意在低溫下操作,,緩慢加入,,充分攪拌,避免局部濃度過高放出大量熱量而使酶蛋白變性,。離心收集沉淀后,,立即將其溶于適量緩沖液中,以避免酶活力的喪失,。

       4.在酶的制備過程中,,每經(jīng)一步處理,都需測定酶的活力和比活力,。唯有比活力提高較大,,提純步聚才有效。

        酶活力的分析:通常是以對—硝基苯磷酸二納(pNPP)為底物,,在PH10.1的碳酸鹽緩沖液(含2mmol/L Mg2+)的測活體系中檢測酶催化pNPP水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯( pNP)在405 nm處有zui大的吸收峰,,可以根據(jù)OD4〇5值的增加計算酶活力的大小。酶活力定義為在37℃下,,以5mmol/L pNPP為底物,,在pH 10.1的碳酸鹽緩沖液含2 mmol/L  Mg2+的測活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 mol/L pNP的酶量定為1個酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù),。 

       蛋白質(zhì)濃度的測定常采用福林-酚試劑(Folin-Phenolreagem)顯色法,。

 

二、實驗用品

(一)器材

    (1) 髙速組織搗粹機和玻璃勻漿器,。

    (2) 離心機,。

    (3) 超級恒溫水浴鍋。

    (4) 酸度計,。

    (5) 722分光光度計,。

    (6)天平、臺秤,。

    (7)透析袋,。

    (8)磁力攪拌器。

    (9)冰箱,。

    (10)秒表,。

    (11)50µL微量進樣器。

 

  (二)試劑

     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5緩沖液:稱取三羥甲基氨基甲烷1.214g,,NaCl5.8g,,溶于蒸餾水中,加入80ml 0.1mol/L HCL,,用蒸餾水定容到1000ml,。

     (2)正丁醇(分析純)。

     (3) 硫酸銨(分析純),。

     (4) 0.5% NaCl:稱取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸餾水中,。

     (5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3  pH 10.1 緩沖液:分別取(A)液 70mL,,(B)液30ml混勻,用酸度計準確調(diào)節(jié)pH 10.1,。

           (A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液:取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸餾水中 ,。    

           (B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液:取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸餾水中,。

     (6) 0.5 mol/L醋酸鎂溶液:稱取醋酸鎂107.25 g溶于蒸餾水中,稀釋成1000ml。

     (7) 0.1 mol/L醋酸鈉溶液:稱取醋酸鈉8.2 g溶于蒸餾水中,稀釋至1000 ml,。

     (8) 0.01 mol/L醋酸鎂-0.01 mol/L醋酸鈉溶液:取0.5 mol/L醋酸鎂20ml醋酸鈉100 mL,,混勻后加蒸餾水稀釋至1000 mL,。 

      (9) PH8.8 Tris.HCl緩沖液:稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g,,用蒸餾水溶解。并稀釋至1000ml,,即為0.1 mol/L Tris溶液,。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL,加蒸餾水約800ml,,再加0.1 mol/L醋酸鎂100 mL,,混勻后用1 %醋酸調(diào)節(jié)pH至8.8,用蒸餾水稀釋至1000ml即可。

    (10) 丙酮(分析純),。

    (11) 95%乙醇(分析純),。

    (12) 20 mmol/L Mgcl2:稱取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸餾水中。 

    (13) 0.1 mol/L NaOH:稱取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸餾水中,。 

    (14)  20 mmol/L 對硝基苯磷酸二鈉(pNPP):稱取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸餾水中,。

    (15) 底物溶液(5mmol/L pNPP):按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2:0.50:.28。 

    (16)0.5µmol/mL對硝基苯酚(pNP=141.1)溶液:稱取17.64mg對硝基苯酚,,用蒸餾水溶解并定容至250 mL,。

    (17) Folin甲

    (18) Folin乙 ,。

    (三)材料

          (1) 新鮮牡蠣,。 

          (2) 新鮮兔肝。

 

三,、實驗程序

  (一)操作方法

     1.牡蠣堿性磷酸酶的分離提取

   (1)稱取100g牡蠣(蒸餾水洗凈),,加入150預先冷卻的0.01mol/L Tris.HCL 緩沖液(PH7.5,含0.1mol/L NaCl),,于高速組織搗碎機勻漿1min,,量勻漿體積,于冰箱4℃放置3h進行抽取,。(留勻漿液10ml,,采用離心或過濾,得到上清液,待測酶的比活力)

   (2)緩慢加入20%(V/V)冰冷的正丁醇,,邊加邊攪拌均勻,。冰箱放置2~3h,。

   (3)室溫離心,,4000r/min 30min,收集離心上清液,,并量體積,。。(留5ml上清液,,對含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L Tris.HCL 緩沖液PH7.5透析平衡,,待測酶的比活力。

   (4)在正丁醇處理的上清液中加入研磨細粉的固體硫酸銨至0.35飽和度(100ml加入20.9g),。緩慢加人,,不斷攪拌溶解,置冰箱靜置4 h,。

   (5) 室溫離心,,4 000 r/min 30 min,收集離心上清液,,并量體積,。(留5ml上清液,對0.01mol/L Tris.HCL 緩沖液PH7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡,,待測酶的比活力),。

   (6) 0.35 mol/L飽和硫酸銨上清液,加入固體研磨細粉的硫酸銨至 0.70飽和度(100ml加入23.8g),。緩慢加入,,不斷攪拌溶解,置冰箱靜置4 h,。

   (7) 室溫離心,,4 000 r/min 30 min,收集沉淀物。(沉淀蛋白上浮,,先把下面清液虹吸出來,,余少量清液連同沉淀一起離心)

   (8) 得到沉淀物,溶于20mL 含 0.1 mol/LNaCl 的 0.01mol/L ris.HCL 緩沖液PH7.5,。裝入透析袋,,先對預冷的0.5% NaCl透析(常換透析液),至無S〇4-2被檢測出為止(可用一定濃度BaCl2溶液檢驗),。再對0.01 mol/L Tris HCl pH7.5緩沖液透析平衡,。 

   (9) 取出酶溶液,冷凍高速離心(0: 25 000 r/min 30 min)。

   (10) 離心上清液即為粗酶制劑,,檢測酶的比活力,。裝人棕色瓶于4冰箱保存。

 

 2.兔肝堿性磷酸酶的分離提取 

   (1) 取2 g新鮮免肝剪碎后,,置于玻璃勻漿管中,,加入0.01 mol/L醋酸鎂,0.01 mol/L醋酸鈉 6ml,,研磨2?3 min,。將勻漿倒入刻度離心管中,記錄其體積,。吸出0.1ml置于另一試管中,,在此試管中加4.9ml PH8.8 Tris HCl緩沖液稀釋,待測比活力,。

    (2) 加2 ml正丁醇于勻漿中,,用玻璃棒充分攪拌2 min左右,然后在室溫中旋轉(zhuǎn)20min,。用濾紙過濾,,濾液置于刻度離心管中。

    (3) 濾液中加入等體積的冷丙酮,,立即混勻后離心(2 000 r/min)5min,,棄去上清液。在沉淀中加入0. 5 mol/L醋酸鎂4 mL,,用玻璃充分攪拌使其溶解,,記錄溶液體積。吸取0.1ml,。置于另一試管中,,在此試管中加入PH8.8 Tris HCl緩沖液4.9ml,待測比活力,。

   (4) 在溶液中緩慢加人冷95%乙醇,,使乙醇zui終濃度達30%,混勻后離心(2000r/min)5min,, 將上清液倒人另一離心管中,,棄去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇,,使乙醇zui終濃度高達60%,,混勻后離心(2 500 r/min)5 min,棄去上清液,,沉淀中加人0.5 mol/L醋酸鎂3ml,,使其充分溶解,,并記錄體積。吸取0.2 mL置于另一試管中,,加入pH8.8 Tris HCl緩沖液3.8ml,,待測比活力。

  (5) 上述溶液中逐漸滴加人冷丙酮,。使丙酮zui終濃度達33%,。混勻后離心(2000 r/min)5 min,,棄去沉淀,上清液則在另一刻度離心管中再緩慢加入冷丙酮,。使丙酮zui終濃度達50%,?;靹蚝箅x心((4000 r/min)10 min,,棄去上清液,,沉淀即為部份純化的堿性磷酸酶,。此沉淀中加入pH8.8 Tris HCl緩沖液4ml使其溶解,并記錄體積,,吸取0. 5 mL置于另一試管中,,加入pH8.8 Tris HCl緩沖液2 mL稀釋,待測比活力,。

 3.比活力測定 

   (1)對硝基苯酚標準曲線的制作:取15支試管編號,,0號一支,1~7號各二支,,按表10-1操作:

 

以對硝基苯酚的量(µmol/L)為橫坐標,,OD405值為縱坐標,繪制標準曲線,。示出pNP的克分子消光系數(shù)(ε)值,。

 (2) 酶活力的測定:

      取干凈的試管21支,編號,0號一支作為空白對照,,以緩沖液代替酶液;1~4號各3支,,作為各步的酶樣測定;1'?4'各2支,作為相應的樣品對照;各管加入1.98ml底物溶液(試劑9),于37恒溫水浴中預熱5 min, 1?4號管分別加人各步酶樣20µl,,反應10min,,各管加入2 mL 0.1 mol/L NaOH終止反應并顯色,0號加入20µTris . HCl緩沖液代替酶液,,1'?4'管先加入NaOH后再分別補加對應的酶液20 µ,。以0號管調(diào)零點,于722分光光度計測定各管的OD405值,,各個測定管的平均OD值減去對照管的平均OD值,,從對照標準曲線求出產(chǎn)物的µmol數(shù),,算出酶活力。

(3)蛋白濃度的測定:

      上述分離提取的四步酶制劑按一定比例用Tris . HCl緩沖液稀釋,,稀釋倍數(shù)視溶液的蛋白濃度高低而定,,以1步驟所提的堿性磷酸酶為例,一般*步和第四步稀釋40?50倍,,第二步稀釋5?10倍,。第三步稀釋2?5倍。 

取千凈的試管13支,,編號,,0號一支作為空白試驗,加入0.5 mLTris . HCl緩沖液稀釋PH7.5,;1~4號管各3支,,作為各步的酶樣測定,各管加人相應的已稀釋的酶液0.5 mL;各管加入Folin-酚試劑甲 4 mL,,室溫放置10 min,,再加入Folin-酚試劑乙0.5 mL,混勻,,放置30 min,。以0號管調(diào)零點,于 722分光光度計測定各管的OD650值,,從對照標準曲線求出各樣品的蛋白濃度,。

 

 4.結(jié)果處理 

  計算:

式中:為透析后的體積變化系數(shù);B為稀釋倍數(shù),,C為由標準曲線査得的pNP(mol/L),,t為反應時間,D為由標準曲線査得的蛋白的質(zhì)量(mg),,V1為測定酶活力所用的酶量(ml),。

 

 

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