實(shí)驗(yàn)原理

Trizol主要物質(zhì)是異硫氰酸胍,，它可以破壞細(xì)胞使RNA釋放出來的同時(shí),，保護(hù)RNA的完整性。加入氯仿后離心,，樣品分成水樣層和有機(jī)層,。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,，RNA 可以通過異丙醇沉淀來還原,。無論是人、動(dòng)物,、植物還是細(xì)菌組織,，Trizol法對少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×10⁶)以及大量的組織(≧1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。Trizol試劑操作上的簡單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成,。Trizol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染,。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交,、poly(A) 選擇,、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆,。

實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol 溶液

氯仿

異丙醇

75%乙醇

DEPC

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超凈工作臺

1.5 mL離心管

移液槍

紫外分光光度計(jì)

石英比色皿

泳槽和模具

電泳儀

凝膠成像系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 采用 Trizol 溶液提取細(xì)菌的總 RNA

    (1)挑取工程菌單菌落,，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取菌液 3 mL 離心得菌體于1.5 mL離心管,；

    (2)每管加入 1 mL Trizol 溶液，蓋緊管蓋,，激烈振蕩15 s,，室溫靜置5 min；

    (3)4℃,，12000 g,，離心 10 min；

    (4)取上清轉(zhuǎn)入（約 1 mL）新的 1.5 m L離心管中,；

    (5)每管加入 0.2 mL 的氯仿（0.2 體積 Trizol）,，蓋緊蓋，劇烈振蕩 15 s,；

    (6)室溫靜置 3 min,；

    (7)4℃, 12000 g, 離心 10 min；

    (8)小心吸取上層水相,，轉(zhuǎn)入另一新的 1.5 mL 離心管,，測量其體積；

    (9)加入1倍體積的氯仿,，蓋緊蓋,，劇烈振蕩 15 s；

    (10)室溫靜置 3 min,；

    (11)4℃,，12000 g，離心 10 min,；

    (12)小心吸取上層水相,，轉(zhuǎn)入另一已編號新的 1.5 mL 離心管；

    (13)加入 0.5 mL 的異丙醇（0.5 體積 Trizol）,，輕輕顛倒混勻,；

    (14)室溫，靜置 10 min,；

    (15)4℃,，12000 g,，離心 10 min，RNA 沉于管底,；

    (16)小心吸去上清,，加1 mL75%的乙醇（預(yù)冷），并輕柔顛倒,，洗滌沉淀,；

    (17)4℃，7500 g,，離心 5 min,；

    (18)小心棄上清，微離,，吸去剩余乙醇,，室溫干躁 10 min；

    (19)各管用 50 μL DEPC 處理過的雙蒸去離子水溶解,，55-60℃溫育5 min,，分裝，-80℃貯存（可貯存5周）,；

2. RNA 濃度的測定

取 10 µL RNA 樣品以雙蒸水稀釋至 2 mL,，轉(zhuǎn)入預(yù)先以無水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除氣泡,，以等體積的雙蒸水作為空白對照,，在紫外分光光度計(jì)中分別測定 260 nm、280 nm,、360 nm（參比波長）的光吸收值,，根據(jù)公式計(jì)算 RNA 的濃度。

RNA 濃度（µg/µL）= OD₂₆₀ × 稀釋倍數(shù)（200）× 40（µg/mL）/1000

純 RNA 樣品的 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值為 1.8~2.0,，若低于該值,，表明存在蛋白質(zhì)污染，可重新用酚∕氯仿抽提,。該值為 2.0 時(shí),，RNA 純度為zui高。

3. RNA 質(zhì)量檢測

將 RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,，目的在于檢測 28 S 和 18 S 條帶的完整性和它們的比值,，或者是 mRNA smear 的完整性。一般認(rèn)為,，如果 28 S和18 S 條帶明亮,、邊緣清晰，并且18 S的亮度在 18 S 條帶的兩倍以上，則 RNA的質(zhì)量較好,。

    (1)將洗凈,、干燥的電泳槽和模具，水平放置在工作臺上;

    (2)準(zhǔn)確稱取 0.15 g瓊脂糖加入 15 mL 1 × TAE 中,，搖勻,，在微波爐內(nèi)將瓊脂糖溶液以zui短時(shí)間*溶解（中火檔 2 min），待冷卻至60℃時(shí),，加入 GoldView（終濃度為 5 µL/mL）,，充分混勻;

    (3)插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱瑢責(zé)岬哪z倒入膠模中,，凝膠厚度為 3~5 mm,，置于室溫下凝固（約 30 min）;

    (4)待凝膠凝固后，小心移去梳子,，將凝膠置于電泳槽中,，加入電泳緩沖液，使液面高出凝膠 1~2 mm;

    (5)用微量移液器將樣品與上樣緩沖液混合并將混合液小心加入上樣孔內(nèi),，同時(shí)加入合適分子量范圍的 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)作為對照;

    (6)蓋上電泳槽蓋，調(diào)節(jié)電壓 100 V,，電泳 40 min 左右;

    (7)電泳完畢后將凝膠置于紫外透射檢測儀上觀察結(jié)果,，用凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

注意事項(xiàng)

1. 提取時(shí)要做到超凈臺內(nèi)操作,、操作帶一次性手套,、EP管及Tip頭都要用0.1%處理（0.1% DEPC浸泡過后，高壓蒸氣滅菌）,、小心,、細(xì)致、晃動(dòng)及每次移液要輕,。這樣做的*目的就是兩個(gè),，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是動(dòng)作過度暴力破壞RNA的完整性,。

2. 一般RNA電泳應(yīng)該是做甲醛變性電泳,，但是一般的瓊脂糖電泳也可以，需要上樣量稍微大些,，并且跑電泳的時(shí)間越短越好（這樣也是為了減少外界RNAse對RNA的降解）,，跑完電泳立刻觀察。