導讀：構建高產細胞株的基本步驟為轉染-篩選-擴增-單克隆化-篩選-馴化,。
   首先,，通過質粒將目的蛋白的編碼基因導入到細胞內。質粒上除了目的基因外還帶有抗性基因,，比如抗生素抗性基因,。這樣在轉染后就可以利用選擇壓力富集整合質粒的細胞。在哺乳動物細胞中質粒不能進行復制,，未整合到基因組中的質粒隨著細胞分裂逐漸丟失,。在一段時間的選擇壓力后，所有存活下來的細胞基因組中都整合了外源質粒,。
   獲得了一系列整合了外源基因的穩(wěn)定細胞后,，接下來就需要從中篩選出表達量zui高的克隆。zui常用的方法是檢測96孔細胞培養(yǎng)板中蛋白的濃度,；另外一個方法是讓細胞在軟瓊脂上生長形成集落,，然后利用原位免疫沉淀技術獲得高產細胞。近年來,，發(fā)展起來的高通量自動化篩選技術也被受關注,。
   為實現克隆的高表達，在有些情況下外源基因擴增,，比如以CHO用作宿主細胞,；有些情況則不需要,，比如雜交瘤細胞。為了實現外源基因的擴增,，將細胞在高濃度的擴增標記（比如dhfr）抑制劑的壓力下生長,。細胞存活需要擴增標記。高濃度的抑制劑能夠殺死除擁有多個擴增標記基因以外的絕大多數細胞,。在標記基因擴增的過程中,，與它相鄰的基因也隨之發(fā)生擴增?；蚩截悢档脑黾訉е罗D錄和翻譯水平的提高,。在這個過程中，某些高產細胞株重組IgG重鏈的轉錄水平成為細胞內zui高,。另一方面,，過高的蛋白表達可能會超過細胞內蛋白折疊的限度，內質網中發(fā)生未折疊蛋白效應導致細胞凋亡,。因此沒有建立起與高表達相匹配的其它結構的細胞可能不能存活,。
     基因擴增后的細胞既含有多個拷貝的外源基因，能高水平的表達目的基因和抗性基因,，還具備了強大的蛋白分泌能力,。除此之外，高產細胞株還應具備高密度培養(yǎng)和能維持較長平臺期的能力,。
    基因擴增后的細胞可以視為一個細胞“Pool”,，其中含有眾多不同遺傳背景的細胞，或是基因插入位點的不同,，或是擴增程度的不同等等,。因此基因擴增后下一步是細胞的單克隆化。單克隆化是利用流式細胞儀或有限稀釋法或其他自動化方式(0.2個細胞/孔)將細胞接種到多孔板中,?？梢哉J為從某一特定孔里長出的細胞都是由早期的一個細胞分裂而來，他們在遺傳上是同源的,。
     單克隆化后需要對獲得的細胞株進行初步的評價,。主要包括生長特性，產品質量的評價,。有些情況下需要將細胞馴化到更接近生產模式的條件下,，進行培養(yǎng)。
     單克隆化細胞株構建過程中的關機環(huán)節(jié),。通常不管是否進行基因擴增都應進行細胞的單克隆化,。盡管用于構建細胞株的宿主細胞都是非整倍體，傾向于進行基因組重排和表觀遺傳學的改變,；但是單克隆化獲得的細胞在同源性上遠高于細胞“Pool”,。從單個細胞開始到生產環(huán)節(jié)結束,，細胞大概需要進行60次分裂；如果算上整個產品的市場壽命,，細胞至少需要80次分裂,。通過單克隆化可以防止zui初細胞“Pool”里發(fā)生突變或產量低細胞成為優(yōu)勢群體，逐漸取代高產細胞,，導致細胞不穩(wěn)定,。