豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（ C.perfringens) 酶聯(lián)免疫分析（ ELISA ）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定豬血清,，血漿及相關(guān)
液體樣本中產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)水平,。
實(shí)驗(yàn)原理 ：
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌
（C.perfringens),。用純化的豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)抗體包被微孔板，制成固相抗
體,，可與樣品中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)相結(jié)合,，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他
成分后再與 HRP 標(biāo)記的豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗
體復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB 顯色,。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在
酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，與 CUTOFF
值相比較，從而判定標(biāo)本中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)的存在與否,。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說(shuō)明書(shū) 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個(gè) 1 個(gè)
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
陰性對(duì)照 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
陽(yáng)性對(duì)照 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標(biāo)試劑 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上
清,，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合 10-20 分鐘后,，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次
離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集,，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。
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4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集,。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞
濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右,。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱(chēng)取重量。加入一定量的 PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度,。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分,。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待
檢測(cè),，其余冷凍備用,。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品,，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟 ：
1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照 2 孔,、陽(yáng)性對(duì)照 2 孔、空白對(duì)照 1
孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照,、陽(yáng)性對(duì)照 50μl。然后在待測(cè)樣品孔先
加樣品稀釋液 40μl,，然后再加待測(cè)樣品 10μl,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不
觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置 30 秒后棄去,，如此
重復(fù) 5 次，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3,。
8. 洗滌：操作同 5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μl，再加入顯色劑 B 50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15 分鐘
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
結(jié)果判定：
試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10
臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)陰性
陽(yáng)性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為豬產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)陽(yáng)性
注意事項(xiàng)
1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未
用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
4． 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。
5．底物請(qǐng)避光保存。
6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí),，參考波長(zhǎng)為 630nm
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7．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸,，使用時(shí)必須
注意安全,。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃,。
2．有效期：6 個(gè)月