雞新城疫病毒抗體V (NDV  Ab) 酶聯(lián)免疫分析（ ELISA ）試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定雞血清,，血漿及相關
液體樣本中新城疫病毒抗體(NDV Ab)的水平。
實驗原理 ：
本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中雞新城疫病毒抗體(NDV Ab) ,。
用純化的雞新城疫病毒抗原包被微孔板,，制成固相抗原，可與樣品中雞新城疫病毒抗體(NDV
Ab)相結(jié)合,，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與 HRP 標記的雞新城疫病毒抗原結(jié)
合,，形成抗原-抗體-酶標抗原復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色,。TMB 在 HRP 酶
的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在 450nm 波長下測定
吸光度（OD 值）,，與 CUTOFF 值相比較,，從而判定標本中雞新城疫病毒抗體(NDV Ab)的存
在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個 1 個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
陰性對照 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
陽性對照 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標試劑 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應再次離心,。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后,，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應該再次
離心,。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程
中如有沉淀形成，應再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞
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濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心 20 分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的 PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用,。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器
將標本勻漿充分,。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待
檢測,，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上
進行試驗,，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含 NaN3 的樣品,，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
操作步驟 ：
1. 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照 2 孔,、陽性對照 2 孔,、空白對照 1
孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰,、陽性對照孔中加入陰性對照,、陽性對照 50μl。然后在待測樣品孔先
加樣品稀釋液 40μl,，然后再加待測樣品 10μ l ,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不
觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘,。
4. 配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置 30 秒后棄去,，如此
重復 5 次，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μ l ,，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3,。
8. 洗滌：操作同 5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μ l ，再加入顯色劑 B 50μ l ,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15 分鐘
10. 終止：每孔加終止液 50μ l ，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測定：以空白空調(diào)零,，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進行,。
結(jié)果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.15
臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.20
陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為雞新城疫病毒陰性
陽性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為雞新城疫病毒陽性
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行,，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未
用完,，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。
4． 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。
5．底物請避光保存。
6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,，使用雙波長檢測時,，參考波長為 630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理,。終止液為 2M 的硫酸,，使用時必須
注意安全。
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保存條件及有效期
1．試劑盒保存：,；2-8℃,。
2．有效期：6 個月