1 使用目的：

本試劑盒用于獸藥樣本中青霉素（Benzyl penicillin， BP）殘留的定量檢測。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競爭ELISA方法,，在微孔板包被有青霉素(penicillin)偶聯(lián)抗原,，加入青霉素(penicillin)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離青霉素(penicillin)與微孔條上預(yù)包被的青霉素(penicillin)偶聯(lián)抗原互相競爭抗青霉素(penicillin)抗體酶標(biāo)記物,，用TMB底物顯色,，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下進(jìn)行檢測,，吸光值與樣品中青霉素(penicillin)含量成反比,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中青霉素(penicillin)的含量。  

3 試劑盒組成

3.1 預(yù)包被的青霉素(penicillin)偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）,。
3.2青霉素(penicillin)標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶）,，含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb,。
3.3抗青霉素(penicillin)抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）,。
3.4顯色液A：1瓶（6ml）。
3.5顯色液B：1瓶（6ml）,。
3.6終止液：1瓶（6ml）,，2M硫酸。
3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,  6ml）,，用于樣品稀釋用,。
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml）,，用于洗板,。
3.9說明書一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 設(shè)備
4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀,。
4.1.2粉碎機(jī),。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器,。
4.1.5漏斗,。
4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。
4.1.7微量移液器,。
4.2 試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水,。
4.2.2 甲醇。
5 貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃,，切勿冷凍
5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6 注意事項(xiàng)
6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書,。
6.2 不要使用過期試劑盒。
6.3 試劑盒使用前,，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，建議至少回溫2小時(shí),。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有青霉素(penicillin)，使用時(shí)應(yīng)特別注意,，操作時(shí)應(yīng)帶手套,。
6.5 終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物,。
6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品所用吸頭不能混用,，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果,。
6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品所用吸頭不得混用,，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡,。
7 工作液準(zhǔn)備
7.1青霉素(penicillin)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb
7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用
7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照
7.4 反應(yīng)終止液：已備用
8 樣品處理程序（樣品在提取過程中,，要嚴(yán)格按說明書操作,，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的樣品,，加 20ml 70%甲醇溶液
8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘
8.3用Whatman 濾紙過濾
8.4取100µl處理后的樣品，加入400µl樣本稀釋液
8.5取50μl稀釋后的樣本進(jìn)行分析（稀釋倍數(shù)5）
9 酶免分析步驟
9.1 實(shí)驗(yàn)須知
9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，時(shí)間約2小時(shí),。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條,，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分,，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。
9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3 請不要改變分析程序
9.1.4 請使用的微量移液器
9.1.5 操作一旦開始,，請不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序,，請嚴(yán)格按照要求操作
9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.1.8 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
9.2 分析步驟
9.2.1 預(yù)*行編號,，標(biāo)記B0,、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測
9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆）,，將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 樣品稀釋液（10×）,、濃縮洗滌液（10×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
9.2.4 在B0孔中加入50µl 0.0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗青霉素(penicillin)抗體酶結(jié)合物
9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。
9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板,，可以減少雙孔誤差）
9.3.1 甩掉孔中液體,，用洗液洗滌微孔板5次,，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
9.4 反應(yīng)
9.4.1 洗滌程序完成后,，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A,，再加 50µl顯色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3 每孔中加入50µl終止液,，混勻
9.4.4 在450nm下檢測吸光度,，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10 結(jié)果計(jì)算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%,，即百分吸光度值,。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
10.1.2以青霉素(penicillin)濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo),，即為青霉素(penicillin)濃度的對數(shù)值,，求得反對數(shù)即為測定液中青霉素(penicillin)濃度C（ppb）
10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù),。
10.2 半定量測定
10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值,。
10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值,。
 

11 特異性
物質(zhì) 交叉反應(yīng)
青霉素(penicillin) 100%

鄰氯青霉素  0.2%

雙氯青霉素  0.1%

阿莫西林   小于0.1%

頭孢塞呋   小于0.1%
12 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測下限為0.1ppb
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％,，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％,。
13 標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb,。

14 分析限制
本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。