分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與使用方法

1. 分光光度法定義,、特點(diǎn)與應(yīng)用
   1.1 定義: 分光光度法是利用物質(zhì)所*的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù).
   1.2 特點(diǎn): 靈敏,,快速和簡(jiǎn)便,在復(fù)雜組分系統(tǒng)中,不需要分離,即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì).
   1.3 應(yīng)用: 生物,、化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質(zhì),核酸,酶等的快速定量檢測(cè).
2. 分光光度計(jì)的分類

紅外分光光度計(jì): 測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760 nm的紅外光區(qū)
可見(jiàn)光: 測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)
紫外: 測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外光區(qū)

1. 工作原理

人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)
它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率zui小的無(wú)線電波到頻率zui大的γ-射線排成一列,即組成電 磁波的波譜.
2.2.1 的光譜范圍
包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其*的 發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜,光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由 紅,橙,黃,綠,藍(lán), 靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光的光源.
氫燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長(zhǎng)的光譜,可作為紫外光光度計(jì)的光源.
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(1)
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線, 即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(2)
當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成 此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過(guò)溶液.
入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過(guò)光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:
入射光 = 吸收光 十 透過(guò)光
2.2.3 物質(zhì)吸光度(A)與透射比(T)的關(guān)系
設(shè) I0 為經(jīng)過(guò)空白校正后入射光的強(qiáng)度;I 為透過(guò)光的強(qiáng)度.
根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知 I = I0 ?10-εc l
式中,c 表示吸收物質(zhì)的摩爾濃度;l 表示吸收物質(zhì)的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質(zhì)的摩爾消光系數(shù),它表示物 質(zhì)對(duì)光的吸收特性,不同物質(zhì)的ε數(shù)值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l
令 T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl
若以T對(duì)吸收物質(zhì)的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線.
由上式可得 1g(1 / T) = εc l
lg(l / T)為物質(zhì)的吸光度(A) A = 1g(1 / T)
2.2.4 Lambert -Beer定律( E = εc l)
上式說(shuō)明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.

1. 的基本結(jié)構(gòu)
   無(wú)論哪一類都包括 :光源,單色器,吸收池,檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表5個(gè)基本部件

4.1 的基本部件(1):

光 源: 上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見(jiàn)光區(qū),近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光 源;在紫外光區(qū)多使用氫弧燈.
單色器:把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置.在中多用作為色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來(lái)盛被測(cè)的溶液.在低于350 nm的紫外光區(qū) 工作時(shí),必須采用石英池或熔凝石英池.  
4.2 的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質(zhì)料,厚度應(yīng)*相同,以免產(chǎn)生誤差.比色皿上的指紋, 油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性,因此在使用前務(wù)必*清洗.
常用光電池,光電管和光電倍增管三種.
測(cè)量裝置 —般常用的紫外光和可見(jiàn)光有3種測(cè)量裝置,即電流表,記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元.現(xiàn)代的 儀器常附有自動(dòng)記錄器,可自動(dòng)描出吸收曲線.
4.3 檢測(cè)器
棱鏡與光柵
棱 鏡: 光波通過(guò)棱鏡時(shí),不同波長(zhǎng)的光折射率不同;因而能將不同波長(zhǎng)的光分開(kāi).玻璃對(duì)紫外線的吸收力強(qiáng),故玻 璃棱鏡多用于可見(jiàn)光.石英棱鏡可在整個(gè)紫外光區(qū)傳播光,故在紫外光中廣為應(yīng)用.
衍射光柵: 在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(每英寸約刻15 000—30 000條).由于刻線處不透光,通過(guò)光的 干涉和衍射使較長(zhǎng)的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.
光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經(jīng)過(guò)一個(gè)入射狹縫,再通過(guò)平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過(guò)棱鏡的光 再經(jīng)另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內(nèi)可得一清楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡使光譜移動(dòng),就 可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個(gè)裝置稱為"單色器"
1) 檢測(cè)器---光電池
光電池裝在一個(gè)特制的匣子里面由3層物質(zhì)組成的圓形或長(zhǎng)方形薄片.*層是一種導(dǎo)電性良好的金屬,這是光 電池的負(fù)極.中間極薄的一層是半導(dǎo)體硒,第3層是鐵,這 是光電池的正極.當(dāng)光電池受光照射以后,半導(dǎo)體硒的表 面逸出電子,這些電子只向負(fù)極方向移動(dòng),而不向正極移動(dòng),因此在上下兩金屬片間產(chǎn)生一個(gè)電位差,線路連通時(shí) 即產(chǎn)生電流
2) 檢測(cè)器---光電管
光電管 光電管是由封裝在真空透明封套里的一個(gè)半圓柱型陰極和一個(gè)絲陽(yáng)極組成.陰極的凹畫(huà)上有一層光電發(fā) 射材料,此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子.當(dāng)在兩極間加有電位 時(shí),發(fā)射出來(lái)的電子就流向絲陽(yáng)極而產(chǎn)生光電流.對(duì) 于相同的輻射強(qiáng)度,它所產(chǎn)生的電流約為光電池所產(chǎn)生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產(chǎn)生的 電 流容易放大 .
3) 檢測(cè)器---光電倍增管
光電倍增管 它比普通的光電管*,它可將*次發(fā)射出的電子數(shù)目放大到數(shù)百萬(wàn)倍 .當(dāng)電子打在兼性陽(yáng)極上 時(shí),能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個(gè)兼性陽(yáng)極所吸引,同樣再產(chǎn)生更多的電子.
此過(guò)程重復(fù)9次后,每個(gè)光子可形成106~107個(gè)電子.這些電子zui后被收集在陽(yáng)極上.所得到的倍增電流可進(jìn)一 步加以放大和測(cè)量.

1. ,帶寬是什么概念,，是越寬越好嗎,？

通常指狹縫寬度,，表現(xiàn)為圖譜的半峰寬,，帶寬越小,，定性時(shí)峰位越明顯,。某種意義上可理解為儀器的分辨率,理 論上越小越好,但實(shí)際由于儀器噪聲的影響,帶寬越小噪聲越大,故需要選擇合適的帶 寬,一般選擇2nm-5nm的帶寬來(lái) 測(cè)試樣品(自然界中99%的樣品都能準(zhǔn)確的測(cè)量出).所以購(gòu)儀器一般要選5nm以下帶寬的儀器. 但是,，帶寬太小，光通量就很小,，在分析中也不適用,。的選擇是帶寬可調(diào)的儀器，根據(jù)自己的實(shí)際需要來(lái)調(diào)整帶寬,。

1. 狹縫寬度和光譜帶寬的關(guān)系

狹縫寬度是毫米級(jí)的,，是光度儀器加工時(shí)的物理尺寸；光譜帶寬是nm級(jí)的,，是儀器的重要分光指標(biāo),，是決定 儀器的分光能力的重要設(shè)計(jì)指標(biāo)。通俗的講光譜帶寬就是通過(guò)狹縫的光所包含的譜帶寬度,，是決定儀器分光的 純度以nm表示,。所以狹縫越窄，光譜帶寬越小,，但不是指只要將狹縫變窄就能達(dá)到光譜帶寬小,，必須同時(shí)其 他硬件條件（包括光源/光柵/檢測(cè)器以及機(jī)械系統(tǒng)等）達(dá)到這個(gè)級(jí)別。

1. 專家支招:如何選擇紫外,？

主要考慮光學(xué)構(gòu)造,、光譜范圍、樣品類型和分析工具,。

研究者們有眾多的新紫外光可選,。自從60年前紫外出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室的工作臺(tái)之后，這種能 解決廣泛難題的儀器可以從單一波長(zhǎng)的測(cè)量到高性能多光譜進(jìn)行測(cè)量分析,。

1;科學(xué)家們選擇時(shí)需要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn) 室的需要和目的用途來(lái)考慮

2;光學(xué)構(gòu)造和光源

3;探測(cè)方法

4;樣品類型

4;數(shù)據(jù)處理

5;其他要考慮的用戶需求因素

光學(xué)構(gòu)造（OPTICAL CONFIGURATION）
一般來(lái)說(shuō),，紫外光分為單光束和雙光束兩類,。顧名思義，單光束型主要是依賴單束光進(jìn)行測(cè)量,。一 束給定波長(zhǎng)的光通過(guò)對(duì)照物,，然后再通過(guò)實(shí)際樣品溶液，就能得到吸光結(jié)果,。

雙光束型則是通過(guò)一個(gè)斬光輪（mirrored chopper wheel）將一束光分成兩束,，分別測(cè)量對(duì)照樣品和實(shí)際樣品。 可以zui小化光漂移（lamp drift）和減少測(cè)量時(shí)間,。一些雙光型光度計(jì)不利用斬光輪,，而是利用一種光束分光器 來(lái)代替，將一束光分成兩束平行的光然后同時(shí)測(cè)量對(duì)照樣品和目的樣品,。因?yàn)樵黾恿藴y(cè)量的速度,，所以雙光束 在測(cè)量一些溶液隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的研究中大有用處。

光源和檢測(cè)方法（LIGHT SOURCES AND DETECTION）
的光譜也是需要考慮的一個(gè)重要因素,。實(shí)驗(yàn)室研究人員希望省錢(qián)購(gòu)入專門(mén)儀器定量核酸,、蛋白或者 細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。例如Amersham Biosciences of Piscataway公司的GeneQuant II能在230,、260,、280、 320,、595和600nm的波長(zhǎng)下測(cè)量樣品,。如果需要更大的靈活性，研究者可以考慮一種更高性能的寬光譜儀 器,，可以程序性地進(jìn)行ELISAs分析和比色分析,。

紫外一般覆蓋190nm和380nm波長(zhǎng)，通常利用氘燈照明,。一些特殊的儀器可以提供滿足光子學(xué) 和半導(dǎo)體研究需要的光譜范圍,。Varian of Palo Alto公司的Cary Deep UV和Hitachi High Technologies of Tokyo的U-7000 Automated Vacuum UV System就是這樣的儀器。

一些儀器具有多種光源供選擇：紫外光,、可見(jiàn)光和甚至紅外光（780 nm 至3,000 nm）,。鎢燈和鹵素?zé)粢话阒?/span> 覆蓋可見(jiàn)光部分（大約380 nm 到800 nm）。而氙燈則可以覆蓋紫外光和可見(jiàn)光區(qū)域,。

的帶寬（bandwidth）很大程度上依賴于單色儀的狹縫的寬度,。可以投射出實(shí)驗(yàn)要求的光譜,。 一種嚴(yán)格帶寬使得儀器能對(duì)復(fù)雜的混合物進(jìn)行高分辨率的吸光測(cè)量,。可變的單色儀的狹縫寬度能使一臺(tái)分光光 度計(jì)滿足多種實(shí)驗(yàn)需要,。

為了測(cè)量吸光值,，制造商通常使用光電倍增管（photo-multiplier tubes,，PMTs）和光敏二極管。 PMTs提供快速的反應(yīng)時(shí)間和良好的靈敏度,，并且可以在紫外光譜調(diào)節(jié)至特定的范圍。但一些制造商依賴于光 敏二極管的動(dòng)態(tài)范圍在數(shù)秒內(nèi)行使所有的光譜測(cè)量,。

樣品類型（SAMPLE FORMAT）
在大部分的樣品類型中,，可接受樣品孔、小玻璃管cuvette,、吸漿管和微孔板,。微孔板主要是滿足高 通量的需要和大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室需求。但盡管對(duì)于小實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō),，制造商仍然提供了多種容器轉(zhuǎn)換器來(lái)滿足通量 的要求和減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間,。

用小試管cuvette裝樣品容量一般從1 μl-5ml，并且一些儀器裝備了各種樣品固定物來(lái)滿足各種改變需要,。體 現(xiàn)了柔韌性,。

數(shù)據(jù)管理（DATA MANAGEMENT）
 大部分單機(jī)型的包含了驅(qū)動(dòng)儀器運(yùn)行和管理數(shù)據(jù)的軟件。高性能的儀器,，通常與PC機(jī)一起聯(lián)用,，需要從制造商提供額外的軟件。同時(shí)用戶也可以選擇升級(jí)軟件以滿足他們的需要,。

另外一個(gè)值得考慮的因素是數(shù)據(jù)的zui終使用,。各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室都有各自感興趣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如一些藥物機(jī)構(gòu)需 要考慮美國(guó)FDA的要求和歐聯(lián)盟的藥物評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)的要求選擇不同的數(shù)據(jù)處理方式,。