Annexin V法細胞凋亡檢測原理

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè),，但在細胞凋亡的早期,，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面,，暴露在細胞外環(huán)境中(圖3),。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS高親和力特異性結(jié)合,。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記,，以標記了的Annexin-V作為熒光探針,，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
　　 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,，它不能透過完整的細胞膜,，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染,。因此將Annexin-V與PI匹配使用,，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

方法
　　 1 懸浮細胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次,，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul,，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul,，避光反應(yīng)5min后,，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）,， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照,。
　　 2 貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌,、染色和分析同懸浮細胞,。
　　 3 爬片細胞染色：同上，zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察,。

　注意事項
　　 1. 整個操作動作要盡量輕柔,，勿用力吹打細胞。
　　 2. 操作時注意避光,，反應(yīng)完畢后盡快在一小時內(nèi)檢測,。