腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法

(一)準(zhǔn)備和安裝過濾器

清洗好過濾器,，干燥,，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜,，用布包裝好,，15磅20 min進(jìn)行高壓滅菌處理,。 在超凈臺(tái)內(nèi)打開過濾器架好,，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中,，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中,。用泵過濾,，過濾后要檢查濾膜是否完好無損。

(二)合成培養(yǎng)基的配制

1,、根據(jù)細(xì)胞目錄中的說明,，按下表選擇合適品牌及貨號(hào)的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解,。

培養(yǎng)基   品牌      貨號(hào)

D-MEM/F-12 GIBCO   12400024

2,、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉,、HEPES等,，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?/span>

3、 調(diào) pH至7.2左右,。

4,、 加水至zui終體積。

5,、 在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過除菌,，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中,，用翻帽塞塞緊瓶口。

6,、 瓶口封好,，4℃冰箱貯存。

(三)小牛血清的處理

市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理,，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理,，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體(近來也有觀點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活,。

1,、 將血清加熱至56℃并保持30 min,，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng),，使受熱均勻,，防止沉淀析出。

2,、 處理后的血清貯存于4℃,。

3、 小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量,。

(四)生長培養(yǎng)基的配制

除無血清培養(yǎng)之外,，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。

1.    培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用,，翻帽塞塞緊瓶口,。

2.    按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％,。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL，,。

(五)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

1.    應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37,。5度,，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。

2.    在無菌臺(tái)內(nèi)將*培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內(nèi),，約5ml左右,，然后用無菌吸管從凍存管內(nèi)取出細(xì)胞，置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃,，使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。

(六)傳代:

1.    貼壁細(xì)胞:

對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好,，以免中和后加入的消化液,，使強(qiáng)度減弱（或PBS洗1－3次）,。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進(jìn)行消化,，(根據(jù)經(jīng)驗(yàn)),，晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落,，加入2-3ml*培養(yǎng)基后，輕輕吹打,，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮,，然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn),。

2.    懸浮細(xì)胞:

一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi),，加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1000rpm,，5min后加入*培養(yǎng)基,，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

(七)凍存

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集,，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以*培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml,。加入10%的DMSO,。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍,。次日保存到液氮中,。

(八)注意事項(xiàng)

1.    玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時(shí)以上;

2.    無菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上;

3.    培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;

4.    消化液(pH7.8)或其它加入液,，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,，分裝成支置-20度保存;

5.    培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌),。至少每月一次,。

6.    進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭,，操作時(shí)注意無菌臺(tái)內(nèi)空間層次,。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數(shù)量較多,，培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作,，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離,，開瓶(蓋)時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，打開后應(yīng)用燈先燒口,，然后燒蓋,。用完后同樣操作。整個(gè)操作過程盡量在無菌臺(tái)靠里面一點(diǎn),。