牛纖連蛋白(FN)ELISA試劑盒實驗指導(dǎo)

本試劑盒僅供研究使用,。

實驗原理

牛纖連蛋白(FN)ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中牛纖連蛋白(FN)水平,。用純化的牛纖連蛋白(FN)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入纖連蛋白(FN),，再與HRP標記的纖連蛋白(FN)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的纖連蛋白(FN)呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中牛纖連蛋白(FN)的濃度,。

牛纖連蛋白(FN)ELISA試劑盒組成

130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

2酶標試劑6ml×1瓶8標準品（1200pg/mL）0.5ml×1瓶

3酶標包被板12孔×8條9標準品稀釋液1.5ml×1瓶

4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份

5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張

6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

牛纖連蛋白(FN)ELISA試劑盒操作步驟

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋,。

600pg/mL5號標準品150µl的原倍標準品加入150µl標準品稀釋液

300pg/mL4號標準品150µl的5號標準品加入150µl標準品稀釋液

150pg/mL3號標準品150µl的4號標準品加入150µl標準品稀釋液

75pg/mL2號標準品150µl的3號標準品加入150µl標準品稀釋液

37.5pg/mL1號標準品150µl的2號標準品加入150µl標準品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、標準孔,、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準品準確加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl,，然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50µl,，空白孔除外。

7.溫育：操作同3,。

8.洗滌：操作同5,。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50µl,，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50µl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

計算

以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

牛纖連蛋白(FN)ELISA試劑盒注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未

用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差,。一次加樣時間

控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4．請每次測定的同時做標準曲線,，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

牛纖連蛋白(FN)ELISA試劑盒保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃,。

2．有效期：6個月