（一）材料與試劑

1．瓊脂粉

2．平皿

3．打孔器

4．生理鹽水或其他緩沖液,，可加1/萬的硫柳汞或疊氮鈉防腐,。抗原

（二）操作方法

1．稱取一定量的瓊脂粉,，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min,。

2．將融化的瓊脂倒入平皿內(nèi),，使厚度2mm～3mm。自然冷卻,。

3．根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑,，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔,。也可直接用組合打孔器打孔?，F(xiàn)在一般多打成梅花形孔圖。

4．挑出孔內(nèi)瓊脂,，注意不要挑破孔緣,。

5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化,，以封底,，以免加樣后液體從孔底滲漏。

6．以毛細滴管吸取樣品加入孔內(nèi),，注意不要產(chǎn)生氣泡,，以加滿為度,。加少了,，影響反應(yīng)程度,，加多了，易溢出,，也影響反應(yīng)結(jié)果,。

7．加畢后，蓋上平皿蓋,，將平皿翻過來,，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h,。

（三）結(jié)果判定

1．用以檢測抗原或比較抗原差異時,，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔,。若出現(xiàn)沉淀帶*融合,，證明為同種抗原；若二者有部分相連,，表明二者有共同抗原決定簇,；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原*不同,。

2．用做血清流行病學調(diào)查時,，將標準抗原置中心孔，周圍1,、3,、5孔加標準陽性血清，2,、4,、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽性孔出現(xiàn)的沉淀帶*融合者判為陽性,。待檢血清無沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶*交叉者判為陰性,。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶，但兩陽性孔的沉淀帶在接近待檢孔時,，兩端均內(nèi)向有所彎曲者判弱陽性,。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者,，判為可疑,，需重檢。重檢時,，可加大檢樣的量,。

檢樣孔無沉淀帶，但兩側(cè)陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時變得模糊、消失,，可能為待檢血清中抗體濃度過大,，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢,。

3．用以檢測的抗血清的效價時,，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔,，以出現(xiàn)沉淀帶的血清zui高稀釋倍數(shù)為該抗血清的瓊擴效價,。

（四）注意事項

1．不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、孔型不規(guī)則,、邊緣開裂,、孔底滲漏、孵育時沒放水平,、擴散時瓊脂變干燥,、溫度過高蛋白質(zhì)變性或未加防腐劑導致細菌污染等所致。

2．抗原抗體的比例與沉淀帶的位置,、清晰度有關(guān),。如抗原過多，沉淀帶向抗體孔偏移和增厚,，反之亦然,。可用不同稀釋度的反應(yīng)液試驗后調(diào)節(jié),。