HRM(High Resolution Melting,，高分辨率溶解曲線)，作為上成熟的點突變掃描與檢測技術(shù),，在人類疾病相關(guān)基因鑒定、植物誘變育種基因突變檢測及基因分型等多個領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在我們就重點關(guān)注一下HRM技術(shù)在植物育種中的具體應(yīng)用,。

    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域中，分子遺傳育種在植物育種中發(fā)揮著越來越大的作用,。HRM之所以作為分子育種中常用的突變檢測,、基因分型技術(shù)，是由于HRM不受突變堿基位點和種類的局限,，無需使用序列特異性探針,，具有高靈敏度、操作簡單,、高通量,、成本低等優(yōu)點。

HRM在植物誘變?nèi)后w中的突變掃描

    為了獲得種質(zhì)資源,，常采用物理誘變,、化學(xué)誘變等技術(shù)處理植物樣本，而這些誘變技術(shù)通常會導(dǎo)致點突變,、小片段插入缺失突變等,。在獲得誘變?nèi)后w后，針對特定基因設(shè)計特異性引物,，采用HRM技術(shù)高通量篩選誘變?nèi)后w,，獲得突變個體。由于HRM技術(shù)速度快、成本低,、通量高,，所以非常適合植物誘變?nèi)后w的點突變掃描。

    在異源六倍體小麥中,，Dong等*次應(yīng)用HRM分析EMS(Ethylmethane Sulfonate,，甲基磺酸乙酯)誘發(fā)的點突變?nèi)后w，實現(xiàn)同時掃描小麥SSII-A,、SSII-B和SSII-D,。他們在SSII-A,、SSII-B和SSII-D的C末端保守區(qū)域上相似性很高的一段序列(532bp含17個SNPs)設(shè)計引物,，分幾個片段(長度約100～250bp)可同時擴增三個基因，然后對小麥農(nóng)家種Ventura的EMS誘變?nèi)后w進行HRM分析,。對140個樣品的未知突變進行掃描,，片段ABD6-1由于其G+C含量高(63.72%)、固有的SNP較多(5 SNIPs)及二級結(jié)構(gòu)造成的影響,，有15個樣品出現(xiàn)差異的熔解峰,，結(jié)合其他手段進一步證實該群體擴增出的ABD6-1片段有8個突變體，而HRM分析掃描出其中的7個,；片段ABD2-9中有6個突變體而HRM掃描出其中的5個,；片段ABD12-22包含的6個突變體均被HRM掃描出?？梢?，HRM掃描未知突變的靈敏度較高(83.3%～100%)，且常受到G+C含量,、二級結(jié)構(gòu),、DNA樣品純度等因素的影響。

HRM在基因分型中的應(yīng)用

    目前主流高通量SNP基因分型方法包括SNP芯片分型技術(shù),、KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)等,，特別適合于需要篩選多個SNP位點且群體量大的樣本群體。除此之外,，HRM分析應(yīng)該是僅次于以上兩種高通量篩選技術(shù)的*選擇,。HRM分析應(yīng)用于植物基因分型，不需要特異性序列探針,，在PCR反應(yīng)后直接對DNA雙鏈逐漸升溫變性熔解,，然后通過光學(xué)檢測系統(tǒng)采集熒光信號變化并繪制溶解曲線，軟件會根據(jù)曲線準確將野生型,、雜合型,、純合型樣本區(qū)分開來,。（如圖）

      HRM實驗的成功，除了周密的實驗設(shè)計外,，一款合適的儀器也是獲得準確實驗數(shù)據(jù)*的保證,。根據(jù)HRM實驗原理，對于儀器來講,，的溫度均一性和高數(shù)據(jù)采集密度是保障實驗成功的核心所在。由于點突變引起的解鏈溫度差異很小,，一般要求儀器的溫度均一性小于0.2度才能檢測出突變引起的溫度差異,，所以儀器的溫度均一性越好，儀器的檢測靈敏度就會越高,。此外,，儀器需要具備高的數(shù)據(jù)采集密度，才能實時地記錄整個過程的溫度變化,。

    瑞士Roche LightCycler 480Ⅱ推出的實時熒光定量PCR系統(tǒng),，以其的性能深受廣大科研工作者的青睞。對于HRM實驗,，LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR系統(tǒng)除了具備以上兩點要求外,，zui大的優(yōu)點在于速度非常快且操作簡便,，專業(yè)的軟件分析功能更有助于突變個體的鑒別,，支持一鍵數(shù)據(jù)導(dǎo)出，方便實用,，是實驗室HRM實驗的*選擇,！