隨著去除核糖體測序技術(shù)深入發(fā)展,,越來越多的環(huán)狀RNA(circRNA)不斷報(bào)道發(fā)現(xiàn),,基于生物信息學(xué)分析顯示circRNA發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能,。然后如何采用實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)一步驗(yàn)證circRNA的生物學(xué)功能顯得尤為重要,,本文帶大家一起探討circRNA功能驗(yàn)證策略,。
1. circRNA定量驗(yàn)證
circRNA定量驗(yàn)證手段與常規(guī)PCR手段不同,常規(guī)手段是圍繞目的片段的上下游分別設(shè)計(jì)PCR引物,,稱之為convergent primer,,需擴(kuò)增的片段位于上下游引物之間(如圖1.1)。而對于circRNA,,尤其外顯子環(huán)化circRNA,,除backsplice junction位點(diǎn)處不同于linear RNA之外,body區(qū)與linearRNA是一致的,。因此,,驗(yàn)證時(shí)需要特異性針對backsplice junction位點(diǎn)處設(shè)計(jì)primer,稱之為divergent primer(如圖1.1),,而且設(shè)計(jì)的PCR product的長度越短越好,,可以增強(qiáng)backsplice junction位點(diǎn)處擴(kuò)增效率。
圖1.1 convergent primer vs divergent primer
為增強(qiáng)circRNA的驗(yàn)證效率,,起始模版需滿足以下要求(3 free):1. DNA free;2. rRNA free,;3. linearRNA free,。
驗(yàn)證策略:對3free RNA以及genome DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測PCR product大小(如圖1.2),。
圖1.2 circRNA引物擴(kuò)增結(jié)果
2. circRNA Northern blot驗(yàn)證
Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗(yàn)證方法,,需圍繞circRNA設(shè)計(jì)探針序列,,而探針序列設(shè)計(jì)是驗(yàn)證成功至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。對于circRNA探針設(shè)計(jì),,我們建議以下兩點(diǎn):1. 對于外顯子環(huán)化circRNA,,建議探針盡可能跨backsplice junction位點(diǎn);2.對內(nèi)含子環(huán)化circRNA,,可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)探針,。
驗(yàn)證策略:對3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時(shí)進(jìn)行雜交驗(yàn)證,。
3. circRNA過表達(dá)
circRNA過表達(dá)思想主要源于circRNA生物形成機(jī)制,,已有多篇文章報(bào)道circRNA成環(huán)機(jī)制,目前比較*的成環(huán)機(jī)制為circRNA側(cè)翼序列的堿基互補(bǔ)配對,,稱之為Alu結(jié)構(gòu)(如圖2),。
圖2 circRNA側(cè)翼結(jié)構(gòu)特征
基于circRNA側(cè)翼Alu序列特征,PCR擴(kuò)增含側(cè)翼Alu序列的目標(biāo)DNA序列,,隨后依據(jù)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切,,進(jìn)而連接pEGFP-C1載體。連接載體進(jìn)而轉(zhuǎn)染對應(yīng)細(xì)胞樣本,,定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率,。基于divergent primer驗(yàn)證circRNA過表達(dá)倍數(shù),。
過表達(dá)策略:1. 擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補(bǔ)序列,,側(cè)翼上下游1kb處過表達(dá)效率更佳;2. 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增基于基因組DNA為模版,。
4. circRNA敲除
circRNA敲除思路主要針對circRNA backsplice junction處序列信息設(shè)計(jì)siRNA,,對于內(nèi)含子環(huán)化circRNA,也可針對內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA進(jìn)行干擾,。Divergent primer驗(yàn)證circRNA敲除倍數(shù),。
敲除策略:
1. 外顯子環(huán)化circRNA,針對backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA,,如圖3所示,;
2. 內(nèi)含子環(huán)化circRNA,除針對backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA序列以外,,也可針對內(nèi)含子區(qū)域序列設(shè)計(jì)siRNA,。
3. 每個(gè)siRNA設(shè)計(jì)對應(yīng)的對照,backsplice junction位點(diǎn)一端互補(bǔ)配對,,另一端錯(cuò)配,,如圖3所示。
圖3 基于siRNA敲除策略
參考文獻(xiàn)
1. New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585.
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4. Cell Reports (2015) 10, 170–177.
來源:聯(lián)川生物技術(shù)公司
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