1．目的

    學會質粒DNA轉化感受態(tài)受體菌的技術,。

2．原理

    質粒DNA粘附在細菌細胞表面，經過42°C短時間的熱擊處理,，促進吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,，待質粒上所帶的抗菌素基因表達,，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。

3．器材

    旋渦混合器,，微量移液取樣器,，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管,，雙面微量離心管架,，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋）,，制冰機,，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp）,，超凈工作臺,，酒精燈，玻璃涂棒,，恒溫培養(yǎng)箱,。

4．試劑

    LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素）,，無菌ddH2O,，IPTG，X- gal,。

5．實驗準備

    無菌ddH2O,，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）,，20%IPTG（M/V）,，2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）,。

6．操作步驟

（1） 事先將恒溫水浴的溫度調到42℃,。細胞

（2） 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100μl）感受態(tài)菌,，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min,。

（3） 加入5μl連接好的質?；旌弦海―NA含量不超過100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min,。

（4） 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,，然后迅速放回冰中，靜置3~5min,。

（5） 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻,，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。

（6） 在超凈工作臺中取上述轉化混合液100~300μl,，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,，待其冷卻后再涂）,。

（7） 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,，8μl 20% IPTG,，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

（8） 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記,，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱。細胞

（9） 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,，擦干桌面,，寫實驗報告。

（10） 觀察平板上長出的菌落克隆,，以菌落之間能互相分開為好,。注意白色菌斑。