細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

一,、原理
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好,，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示,。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同,。
在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力,，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力,，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力,，了解凍存和復(fù)蘇的效果,。
用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色,，活細(xì)胞不著色,，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng),，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力,。
二、儀器、用品與試劑
1,、儀器與用品：普通顯微鏡,、血球計(jì)數(shù)板、試管,、吸管,、酶標(biāo)儀（或分光光度計(jì)）
2、試劑：0.4％臺(tái)盼蘭,，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）,、酸化異丙醇
3、材料：細(xì)胞懸液
三,、操作步驟
（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)
1,、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上,。
2,、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣,，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。
3,、靜置3分鐘,。
4、鏡下觀察,，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù),，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好,，需重新制備細(xì)胞懸液,。
（二）細(xì)胞活力
1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中,。
2,、加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘,。
3,、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片,。
4,、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。
死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色,，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細(xì)胞,，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀,。
活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行,，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。
（三）MTT法測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍,。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比,，也與細(xì)胞活力呈正比。
l,、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘,，棄上清液。
2,、沉淀加入0.5－1ml MTT,，吹打成懸液。
3,、37℃下保溫2小時(shí),。
4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）,。打勻,。
5、1000 rpm離心,，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)570nm比色,，酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。
注意：MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力,，不能測(cè)定細(xì)胞數(shù),。
附：1、0.4%臺(tái)盼蘭染液配制：
臺(tái)盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml,。
2,、MTT配制：
MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無(wú)酚紅的基礎(chǔ)液中,。4℃下保存,。
3、酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入HCl使zui終達(dá)0.04mol/L,。